紫娟茶中花青素提取物含量的不確定度評定

戴妙妙（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海201114）

紫娟茶中花青素提取物含量的不確定度評定

戴妙妙
（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海201114）

紫娟茶由含酸甲醇提取后，經(jīng)過乙醚、氯仿的液液分配以及Amberlite XAD-7HP樹脂的吸附洗脫，得到花青素粗提物。針對花青素提取物，采用DPPH法研究探討了其抗氧化性及清除自由基的能力，并針對抗氧化性試驗進行了不確定度的評定，得到的擴展不確定度為0.132 2（以Trolox mg/kg計），說明測量結(jié)果有較高的質(zhì)量，使用這種抗氧化方法得到的結(jié)果是可信的。本研究的結(jié)果為紫娟茶花青素的深入研究與有效開發(fā)利用，提供了必備的表征條件和理論參考，并有助于食品原料的深度加工和功能性檢測方法的應用與開發(fā)。

紫娟茶；花青素；抗氧化性；不確定度

紫娟茶樹［1］是一種較特異的植株，具有紫莖、紫葉、紫芽（紫色的芽尖）的特征，以諧音為其取名“紫娟”（Zi juan）。紫娟茶葉與普通的紫芽茶葉不同，特別是外形明顯不同，其加工成的烘青綠茶，干茶的色澤為紫色，湯色也為黑紫色，香氣純正，滋味濃強，在國內(nèi)茶葉中也屬于較罕見的品種。

紫娟茶中含有種類豐富的活性成分，其芽葉經(jīng)過蒸餾得到的浸出物含量為44.58%，茶多酚（Tea Polyphenols）的含量為 35.52%，咖啡堿（Theine）31.01 mg/g，花青素29.14mg/g，黃酮類化合物12.82mg/g，鋅30.25 mg/kg，氨基酸總量346.19 mg/g，兒茶素（Catechin）總量201.86 mg/g，其中的花青素含量高出普通紅芽茶（5 mg/g～10 mg/g）兩倍［2］。根據(jù)云南省茶葉研究所生化試驗分析證明，紫娟茶有降血壓、降血脂、預防心腦血管疾病、抗高蛋白過敏及抗HIV宿主細胞功效等作用，并能緩解眼疲勞、預防視力下降等功效。其較高含量的鋅、黃酮類、超量的花青素是其呈現(xiàn)上述功效的主要物質(zhì)。

花青素作為天然抗氧化劑在食品工業(yè)中有著廣闊的發(fā)展空間，由于食品安全是重大民生問題，因此國家對食品檢測也高度關(guān)注。從檢測行業(yè)來說抗氧化性檢測將會是一個熱門焦點，也就是說對抗氧化性檢測的不確定度評定將是一個重要的環(huán)節(jié)。

不確定度（Uncertainty）［3］是一個表示測量結(jié)果與被測量值分散性的參數(shù)。它是度量測量結(jié)果可信程度的一個最重要的依據(jù)。測量結(jié)果是否能被采用很大程度上取決于其的不確定度大小。不確定度越小，表明測試結(jié)果越接近于被測量的真值（True value of a quantity），質(zhì)量越是高，其可以被其他使用該測試方法的人使用；反之，不確定度過大，說明測量結(jié)果的水平過低，其沒有被使用的價值。在ISO/IEC導則25中明確，實驗室的每個報告，都必須包含測試結(jié)果不確定度的說明［4］。在ISO/IEC 17025：2005中規(guī)定，測試報告需伴有評估測量不確定度一同出具［5］。所以，不確定度評定在檢測領(lǐng)域中的重要性不言而喻。

1　材料與方法

1.1原料

紫娟茶：市售，于4℃冰箱保藏，待用。

1.2儀器

CP214C電子天平：Ohaus；RE5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FE20精密pH計、XS105DU分析天平：Mettler Toledo；HHS-21-4孔型電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療機械五廠；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；90-1恒溫磁力攪拌器：上海精科實業(yè)有限公司；LGJ-18C冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；P1000、P5000移液器：Gilson；PE Lambda25紫外可見分光光度計：Perkin Elmer。

1.3試劑

甲醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚（均為AP純）、無水乙醇（HPLC純）：國藥集團化學試劑有限公司；三氯乙酸（TFA，HPLC純）：Aladdin；Amberlite XAD-7HP大孔吸附樹脂：Rohm&Haas；純度＞98.0%（GC）（T）的水溶性VE（Trolox）、純度＞97.0%的1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）：CTI。

1.4花青素的制備［6］

稱取300 g紫娟茶葉于5 L燒杯中，加1 L 2% TFA甲醇浸提液至浸沒茶葉，4℃下避光靜置21 h，過濾收集濾液，殘渣繼續(xù)用1 L 2%TFA甲醇浸提液浸泡，4℃下避光靜置4 h，收集濾液，共重復3次。合并3次浸提濾液，得到紫娟茶浸提濾液約4 L。4 L紫娟茶浸提濾液在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸去甲醇，直至無甲醇殘留，得到紫娟茶粗提液約500 mL，調(diào)節(jié)pH＜2。500 mL紫娟茶粗提液，先用乙醚進行3～5次萃取，每次乙醚使用100 mL～200 mL，直至有機層無色顯現(xiàn)，收集水層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，乙醚能除去紫娟茶粗提液中的脂質(zhì)脂溶性色素等；再用氯仿進行3～5次萃取，每次氯仿使用100 mL～200 mL，至有機相無色，取水層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，水溶液濃縮至300 mL，調(diào)節(jié)pH＜2，氯仿能除去紫娟茶粗提液中的咖啡堿。將300 mL紫娟茶粗提水溶液以16 mL/min的流速，緩慢滴入層析柱（Φ2.5 cm×60 cm）中，靜置20 min～30 min，使其充分吸附在樹脂上［7］。先用1 L 0.1%TFA水溶液洗脫，除去一些水溶性的單糖、氨基酸等小分子的雜質(zhì)；再用2 L 0.1%TFA甲醇溶液洗脫，直至無有色物質(zhì)洗脫下來，收集洗脫液。將紫娟茶粗提洗脫液在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸去甲醇，直至無甲醇殘留，再將其置于-60℃冷阱中冷凍6 h，隨后在1.0 Pa真空度下冷凍干燥18 h以上，得到紫娟茶粗提物27.6 g。稱取上述20.0 g紫娟茶粗提物于燒杯中，加400 mL乙酸乙酯，磁力攪拌30 min，進行3次固液萃取，收集不溶固體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸去乙酸乙酯，直至無乙酸乙酯殘留，再將其置于-60℃冷阱中冷凍6 h，隨后在1.0 Pa真空度下冷凍干燥18 h以上，得到花青素粗提物4.3 g，于4℃冰箱保藏備用。

1.5DPPH反應體系中的抗氧化性試驗［8］

稱取0.001 g樣品于燒杯中，加無水乙醇溶解，移入容量瓶中，加無水乙醇定容至50 mL。吸取1 mL樣液，移入容量瓶中，加4 mL 0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液，定容至5 mL，室溫靜置30 min，用比色皿，于517 nm波長處，測定吸光度值。以乙醇代替樣品做空白。計算結(jié)果以Trolox mg/kg計。

2　結(jié)果與分析

2.1數(shù)學模型

在此是把測量中用作獲得被測量的計算公式當為數(shù)學模型，因為該公式中已將所有對檢測結(jié)果有影響的輸入量都顯現(xiàn)了出來。

式中：W為樣品濃度（以Trolox計），mg/kg；C0為樣品液校正后濃度，mg/mL；V為樣品定容體積，mL；V0為樣品進樣量，mL；V1為反應體系體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g；Frec為回收率校正因子。

2.2不確定度分量來源分析

分析結(jié)果的測量不確定度的來源主要包括4個方面：1）外標法校準過程引入的不確定度。在外標法校準過程中，由最小二乘法線性擬合帶來的不確定度、標準品不確定度以及配制過程中天平、移液管、容量瓶允差及溫度不同的不確定度。2）樣品質(zhì)量不確定度。它是由稱量樣品天平的最大允差帶來。3）體積引入不確定度。該不確定度包括移液器和容量瓶校準產(chǎn)生的不確定度、溫度和重復性變化。4）樣品顯色過程對回收率影響導致的不確定度。這4個方面不確定度的因果關(guān)系如圖1所示。

2.3不確定度分量評定［9-11］

2.3.1C0的標準不確定度u（C0）

1）用最小二乘法擬合標準曲線校準所產(chǎn)生的不確定度

圖1因果關(guān)系圖Fig.1　Cause and effect diagram

用5種濃度標準溶液，紫外可見分光光度計測定3次，得到吸光度值Y，用最小二乘法進行擬合，得到直線方程（a為斜率，b為截距）和線性相關(guān)系數(shù)r。

根據(jù)數(shù)學模型求方差和傳播系數(shù)

方差：uc2（X）=c2（Y）u2（Y）+c2（a）u2（a）+c2（b）u2（b）

5個濃度水平，每個濃度進樣3針數(shù)據(jù)如表1。

表1 校準曲線數(shù)據(jù)Table 1　The data of the calibration curve

根據(jù)數(shù)據(jù)利用工作站繪制校準曲線，得方程Y= 0.904 0-111.51X；r=0.998 8

由方程可得：a=-111.51，b=0.904 0；

樣品質(zhì)量M為0.001 g，樣品定容體積V為50 mL，樣品進樣量V0為1 mL，反應體系體積V1為5 mL，測得C0=0.003 3 mg/mL。

①回歸曲線的標準偏差（即y的標準偏差）

式中：Yij為標準物質(zhì)和各自內(nèi)標物在儀器上的響應值比值；Yi為回歸曲線的計算值；n為測量點個數(shù)；m為每個測量點重復的次數(shù)；為自由度。

計算各個Yi和Yij－Yi值，如表2。

表2　Yi和Yij-Yi值數(shù)據(jù)Table 2　The data of Yiand Yij-Yi

可由表算得：

自由度為：m·n-2=3×5-2=13

②斜率a的標準偏差

自由度為：m·n-2=13

③截距b的標準偏差

自由度為：m·n-2=13

2）計算不確定度分量

u1是Y殘差的標準偏差SY/X

u1=SY/X=0.013 537 19A

自由度：v1=m·n-2=13

傳播系數(shù)：c（y）=1/a=-0.008 967 81 mg/mL/A

標準物質(zhì)引入的不確定度u2

梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司（CTI）提供標準物質(zhì)水溶性VE（Trolox），純度Specifications min 98.0%（GC）（T），Results 99.9%（GC）（T）。正態(tài)分布變化，置信因子k=2，置信概率p=95%。

u2=0.969%/98.0=0.000 098 92

自由度：v2=∞

傳播系數(shù)：c（y）=-0.008 967 81 mg/mL/A

重復測定u3

重復測量標準溶液各10次，取5個點中測量數(shù)據(jù)標準

自由度：v3=n-1=10-1=9

傳播系數(shù)：c（y）=-0.008 967 81 mg/mL/A

自由度：v=m·n-2=13

③u（b）=Sb=0.007 381 15A

自由度：v=m·n-2=13

u（C0）的各不確定度分量結(jié)果見表3。

表3　u（C0）不確定度分量表Table 3　The uncertainty subscale of u（C0）

2.3.2樣品質(zhì)量不確定度u（M）

電子天平證書給出MPE值±0.000 02 g，均勻分布變化，置信因子，置信概率p=100%。

2.3.3體積引入不確定度u（△V）

稱取0.001 g樣品于燒杯中，加無水乙醇溶解，移入容量瓶中，加無水乙醇定容至50 mL。吸取1 mL樣液，移人容量瓶中，加4 mL 0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液，定容至5 mL，室溫靜置30 min，用比色皿，于517 nm波長處，測定吸光度值。

2.3.3.150 mL A級容量瓶的不確定度uv1

其中包括三個部分：第一，容量瓶體積的不確定度，容量瓶（50 mL）的容量允差為±0.05 mL，按均勻分布換算成標準偏差為=0.028 87 mL；第二，定容時的估讀誤差，估計為±0.005 mL，按均勻分布換算成標準偏差為=0.002 887 mL；第三，容量瓶和溶液的溫度與校正時的溫度不同引起的體積不確定度，設(shè)溫度變化范圍（20±5.0）℃，膨脹系數(shù)α=2.1×10-4，置信因子，按矩形分布變化換算成標準偏差為

2.3.3.25 mL A級容量瓶的不確定度uv2

2.3.3.35mL移液器的不確定度uv3

其中包括3個部分：第一，廠家給出的移液器（5 mL）系統(tǒng)誤差為±0.03 mL，按均勻分布換算成標準偏差為0.017 32 mL；第二，重復測量的不確定度為±0.008mL，按均勻分布換算成標準偏差為0.004619mL；第三，移液器和溶液的溫度與校正時的溫度不同引起的體積不確定度，設(shè)溫度變化范圍（20±5.0）℃，膨脹系數(shù)α=2.1×10-4，置信因子，按矩形分布變化換算成標準偏差為0.003 031。

2.3.3.41 mL移液器的不確定度uv4

所以：

2.3.4樣品提取過程對回收率影響導致的不確定度

對樣品進行加標回收，通過10次回收，計算回收率。見表4。

根據(jù)貝塞爾公式：

標準偏差：S（CRec）=0.097 160

不確定度具體表現(xiàn)在10次測量樣品回收率平均值的標準偏差 S（CRec），標準不確定度

當t值大于或等于雙邊臨界值t（95.2）=4.30時，則與1有顯著性差異，說明frec必須使用修正結(jié)果。反之，則不使用。計算結(jié)果見表5。

表5　ucrel（W）Rec顯著性檢驗Table 5　Significant test of ucrel（W）Rec

3　結(jié)果與討論

3.1合成不確定度

3.2擴展不確定度U

根據(jù)國際慣例，取擴展因子k=2，置信概率p=95%。

3.3不確定度分量列表

各不確定度分量對擴展不確定度U的影響見圖2。

圖2 不確定度分量圖Fig.2　Uncertainty component diagram

4　結(jié)論

應用DPPH反應體系中花青素濃度（以Troloxmg/kg計）的測量結(jié)果進行評定，得到合成標準不確定度為0.066 091（以Trolox mg/kg計）和擴展不確定度為0.132 2（以Trolox mg/kg計），從數(shù)值上來說本標示的不確定度較小，所述結(jié)果與被測量的真值較接近，質(zhì)量較高，水平較高，它使用價值也較高。所以符合本文測量條件的測量結(jié)果，一般可參照使用本不確定度的評定結(jié)果以考察結(jié)果的準確性。通過對各不確定度分量的評估，從中找出其最大分量為urel（C0），對產(chǎn)生這一分量的測試要素——樣液校正后濃度，加以控制，就可獲得更準確、更精確的測試結(jié)果。測量不確定度評定在實際工作中有重要意義，特別是在檢測結(jié)果為臨界值時顯得尤為重要。本方法在實際檢測工作中具有較強的應用價值。

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Evaluation for Measurement Uncertainty of Anthocyanins from Zi Juan Tea

DAI Miao-miao
（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 201114，China）

Anthocyanins from Zi juan tea were exteacted by using acid-containing methanol as solvent and patitioned with ether and chloroform.The extract of anthocyanins was purified by Amberlite XAD-7HP chromatography.The antioxidant and free radical scavenging capacity of anthocyanin extracts were evaluated by DPPH method.The uncertainty of the antioxidant was assessed.The expanded uncertainties were 0.132 2（Trolox mg/kg），which showed that the level of the measurement had the high quality and the data resulted by these methods was worth believing.This study will provide scientific basis for developing and utilizating of Zi juan tea and contribute the depth of processing of food materials and functional application.

Zi juan tea；anthocyanin；antioxidant activity；uncertainty

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.040

戴妙妙（1984—），女（漢），工程師，工程碩士，研究方向：產(chǎn)品安全研究。

2015-04-14