云南傳統乳扇制品中優質乳酸桿菌的篩選與鑒定

李周勇，陳云，史玉東，楊嵐，母智深（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司研發中心，內蒙古呼和浩特011500）

云南傳統乳扇制品中優質乳酸桿菌的篩選與鑒定

李周勇，陳云，史玉東，楊嵐，母智深*
（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司研發中心，內蒙古呼和浩特011500）

從云南省洱源縣鄧川、江尾等地區多戶白族居民家中共采集到乳扇及其酸湯樣20余個，從中分離到乳桿菌39株。經試驗篩選，其中3株具有優良的發酵特性，它們分別是YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36。經16s rDNA種屬鑒定與API50糖發酵試驗相結合，確定YNEY-15為副干酪乳桿菌副干酪亞種3、YNEY-28為植物乳桿菌2、YNEY-36為德氏乳桿菌保加利亞亞種。將3株乳桿菌與實驗室保藏的嗜熱鏈球菌進行組合發酵，并將產品與市售酸奶進行對照，最終確定YNEY-36為目標菌株，具有繼續研究成為酸奶發酵劑的可能性。

發酵特性；乳酸桿菌；分子鑒定；組合發酵

分離篩選具有優良發酵特性的乳酸菌，開發出擁有完全自主知識產權的酸奶發酵劑對我國乳品工業的發展有著十分重要的意義。乳酸菌的產酸、產黏、后酸化及產香等發酵特性對發酵乳的口感、風味、質地和營養價值有著極其重要的作用［1］。近年來，時常有學者從我國不同地區的不同傳統發酵食品中分離得到具有優良特性的乳酸菌，并投入到工業生產中［2］。

云南省地域遼闊，少數民族眾多，傳統乳制品加工歷史悠久，且制作方法繁多［3］。云南大理洱源地區的白族居民具有悠久的生產加工和食用乳扇（Dairy Fan）的歷史。乳扇的制作工藝是一個典型的牛乳自然發酵過程［4］。養牛戶在自產奶中加入前次生產乳扇時留下的酸湯即酸乳清作為自然發酵劑，待開始凝乳時，加熱至牛奶呈半固體狀態，制成扇狀或條片狀，在自然條件下風干，即為新制成的乳扇［5］。新制乳扇低溫下保質期為30天左右，食用時可煎炒或蒸食，風味鮮香獨特。試驗對乳扇及其酸湯中的乳桿菌進行了分離鑒定及發酵特性研究，為乳扇中微生物的研究提供一定的數據參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試劑

蒙牛原味酸奶：市售；雀巢脫脂乳粉、0.1 mol/L NaOH、甘油、結晶紫染液、酚酞、乙醇、番紅染液：北京陸橋技術有限公司。

1.1.2菌株

39株乳桿菌：采自云南省洱源縣鄧川、江尾等地多個白族家庭自制的傳統乳扇及其酸湯，使用超低溫冰箱于-80℃保存；嗜熱鏈球菌MN01：蒙牛研發中心微生物試驗室保藏。

1.1.3培養基

MRS瓊脂培養基、MRS液體培養基、12%脫脂乳培養基（115℃、15 min滅菌）、API50CHL糖發酵培養基：北京陸橋技術有限公司。

1.2試驗設備

Premium U410超低溫冰箱：美國NBS公司；CP21GⅡ高速冷凍離心機：日立公司；HV-110高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；G560E漩渦混合器：美國SCIENTIFIC Instruments公司；Sartorius pH計：北京賽多利斯儀器系統有限公司；CINAC乳品發酵監控儀：法國Alliance；LVDV-Ⅱ旋轉式粘度計：美國Brookfield公司；SVE-6A1超凈臺：新加坡ESCO公司。

1.3方法

1.3.1乳桿菌的活化及純化

采用濃度為12%的脫脂乳培養基三代活化凍存的39株乳桿株，并于MRS培養基上劃線接種，37℃條件下培養48 h。挑取單菌落繼續于MRS培養基上劃線培養，革蘭氏染色鏡檢［6］，直到確認為純菌。采用MRS斜面培養基劃線接菌培養，于4℃冰箱內保藏備用。

1.3.2優良發酵特性菌株的篩選

酸度測定方法：發酵乳樣品凝乳后，經24 h后熟，采用國標規定的酸堿滴定法測定酸度［7］。

粘度測定方法［8］：采用LVDV-Ⅱ旋轉式粘度計做一點式測定，經預試驗探索，最終確定在4℃條件下，使用92號轉子，2 r/min轉速，測量10 s記數。重復3次取算術平均值，單位為mPa·s。

發酵特性篩選試驗：

1.3.2.1凝乳時間

活化并純化好的菌株按2%的接菌量接種到12%的脫脂乳內，混勻后置于43℃下恒溫發酵，采用乳品發酵監控儀連續測定樣品pH，以0.5 h為最小單位，記錄樣品pH降低到4.6及4.6以下所用的時間，即為菌株發酵脫脂乳的凝乳時間。

1.3.2.2產酸速度［9］

樣品在發酵初始和15 h時，分別測定pH及酸度。計算每小時pH和酸度的平均變化量即為相應菌株的產酸速度。

1.3.2.3后酸化程度［10］

12%的脫脂乳在接菌后的發酵過程中，定點在15 h和60 h時，分別測定脫脂乳樣品的pH和酸度。計算此45 h內平均每小時pH及酸度的變化量，即為菌株發酵的后酸化程度。

1.3.2.4黏度測定

根據前期試驗結果，選擇凝乳時間在6 h內、產酸速度快且后酸化程度相對較弱的菌株進行發酵。至樣品凝乳后，取出破乳，并置于4℃條件下后熟24 h，取出采用一點式測定樣品黏度。

1.3.3菌株鑒定

1.3.3.116s rDNA鑒定［11］

采用美國Promega細菌DNA提取試劑盒進行菌株的DNA提取，并進行PCR擴增。

PCR擴增：體系50 μL，反應條件為：95℃/5 min、95℃/30s、50℃/30s、72℃/1min，31個循環；75℃/5 min。收集PCR產物后，送由天津生物芯片責任有限公司進行測序并比對結果。

1.3.3.2API50輔助鑒定［12］

目前，任何一種分子生物學的方法都無法單獨完成對所有乳酸菌的鑒定。必須與傳統的生化試驗相結合才能將鑒定結果做到最好。16s rDNA鑒定也不例外，其結果有時無法將菌株鑒定至種水平。API50CHL是由含有49種碳水化合物的試驗條組成的簡易型培養基，適于乳酸桿菌和相關菌的鑒定。采用16s rDNA鑒定的方法，結合API50的鑒定結果，能較好地將乳桿菌鑒定至種水平。

1.3.4組合發酵試驗

將篩選出的發酵特性較好的乳桿菌與標準嗜熱鏈球菌按1∶1的接種比例［13］，3%的接菌總量進行組合發酵。以市售蒙牛原味酸奶為參照，在樣品后熟24 h后進行各項指標測定，綜合評定篩選出的菌株是否具有進一步開發成為酸奶發酵劑的可能，菌株組合比例的優化在此不做研究。

1.3.4.1酸奶制作工藝［14］

牛奶（雜菌＜5×105CFU/mL）→配料加入8%白砂糖、攪拌1 h→均質（20 MPa）→高溫滅菌（95℃，5 min）→冷卻至42℃→接種（接種量3%）→恒溫發酵（42℃）→破乳后，4℃后熟24 h。

1.3.4.2測定指標

黏稠度：粘稠度的測定采用LVDV-Ⅱ旋轉式粘度計進行，通過前期預試驗，選擇62號轉子，50 r/min，在4℃條件下，測定10 s計數。照此方法重復測量3次取平均值，黏稠度單位為mPa·s。

乳清析出率［15］：取100 g 4℃條件下貯藏的酸奶樣品，倒入含120目鋼絲網的漏斗中靜置2 h，收集下方析出的乳清并稱重。乳清析出率/%=乳清的質量（g）/樣品的質量（g）×100

感官品評：由蒙牛研發中心的20名感官品評小組成員，對發酵乳樣品的總體感官（包括色澤、組織狀態及滋氣味等）進行評價。總分高于90的，為優質酸奶；總分介于80至90之間的，為良質酸奶；總分低于80的，為次質酸奶。酸奶感官評定標準如表1所示。

表1　酸奶感官評定標準［16］Table 1　Standard of organoleptic investigation for yogurt

2　結果與分析

2.1乳桿菌分離純化結果

試驗從云南省洱源縣鄧川、江尾等地區多戶白族居民家中共采集到乳扇及酸湯樣20余個。通過革蘭氏染色鏡檢及過氧化氫酶試驗，初步確認從中分離到乳酸菌76株，其中含乳酸桿菌39株，根據菌株來源依次命名為“YNEY-”系列。經多次傳代純化以后，采用MRS斜面培養基劃線接菌培養，于4℃冰箱內保藏備用。

2.2優良發酵特性菌株篩選結果

2.2.1菌株產酸試驗結果

2.2.1.1凝乳時間測定結果

采用乳品發酵監控儀連續測定樣品pH，對樣品凝乳時間進行監控，測定結果見表2。

表2　凝乳時間測定結果Table 2　Measurement results of curd time

續表2 凝乳時間測定結果Continue table 2　Measurement results of curd time

由以上試驗結果可以看出，39株乳桿菌在43℃恒溫箱中發酵，共有12株菌能在6 h內發酵脫脂乳至凝乳。它們分別是YNEY-01、YNEY-06、YNEY-07、YNEY-10、YNEY-15、YNEY-16、YNEY-17、YNEY-23、YNEY-28、YNEY-31、YNEY-36、YNEY-38，各自凝乳時間從3.5 h～6 h不等。因此，保留這12個乳桿菌進行后續其它發酵特性試驗并進行對比評價。

2.2.1.2產酸速度及后酸化測定結果

在固定時間點測定樣品的pH和酸度，測得不同菌株產酸速度及后酸化結果如表3所示。

表3　菌種產酸速度及后酸化測定結果Table 3　Measurement results of speed of strains produce acid and degree of after acidification

由以上試驗結果可以看出，產酸速度相對較快的乳桿菌共有7株，分別是YNEY-06、YNEY-07、YNEY-15、YNEY-16、YNEY-28、YNEY-31及YNEY-36。通過數據分析我們得知，它們的產酸速度和其余菌株差異顯著。其中，YNEY-16和YNEY-31的后酸化度嚴重，酸度變化分別為1.64°T/h和1.84°T/h，與其余5株菌差異顯著。因此，最終選擇產酸速度快且后酸化程度弱的5株菌YNEY-06、YNEY-07、YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36進行后續的黏度試驗。

2.2.2菌株產黏結果

樣品在4℃環境下后熟24 h后，黏度測定結果如表4所示。

表4 菌種黏度試驗結果Table 4　Results of strains produce viscosity

通過表4可以看出，不同菌株發酵樣經4℃環境后熟24 h后，黏度差異明顯。YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36發酵樣的黏度較大，分別為6 842 mPa·s、6 514.5 mPa·s和7 674.5 mPa·s，經分析與YNEY-06、YNEY-07發酵樣的黏度值差異顯著。

根據以上結果，試驗初步確認篩選出3株具有較好發酵特性的乳桿菌，分別是YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36，它們同時具有較好的產酸和產黏特性。試驗最終選擇這3株菌進行鑒定，并繼續下一步的混合發酵試驗。

2.3菌株種屬鑒定結果

2.3.1菌株16s rDNA分子鑒定結果

經16s rDNA分子鑒定，結果顯示，YNEY-15與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）的16s基因序列同源性高達100%，基本可確定為副干酪乳桿菌。YNEY-28的16s基因序列同時與戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）有著相同的99.8%的同源性，暫時無法區分其種屬。YNEY-36與德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）的16s基因序列有著高達100%的同源性，可基本確定為德氏乳桿菌。

2.3.2菌株API50發酵結果

菌株YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36與API50 CH試驗條中的49種不同可發酵碳水化合物反應，所得的反應圖譜如圖1所示。

根據圖1中YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36的API50反應圖譜，與API50反應標準圖譜對照表［17］進行比對，試驗最終確定YNEY-15為副干酪乳桿菌副干酪亞種3（Lactobacillus paracasei ssp paracasei 3），YNEY-28為植物乳桿菌2（Lactobacillus plantarum 2），YNEY-36為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus）。

2.3.3菌株組合發酵試驗結果

將菌株YNEY-15、YNEY-28、YNEY-36與標準嗜熱鏈球菌混合發酵，試驗結果見表5。

圖1菌株YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36的API50鑒定圖譜Fig.1　API50 identification map of YNEY-15、YNEY-28 and YNEY-36

表5 菌株組合發酵試驗結果Table 5　Test results of strains mixed fermentation

由表5可知，3個試驗組酸奶發酵樣品的乳清析出率均高于參照組，但差異并不顯著。YNEY-36+ MN01發酵樣品的黏度略高于參照組，但無明顯差異；YNEY-15+MN01和YNEY-28+MN01樣品的黏度均顯著低于參照組，可能是由于試驗菌株和標準菌株之間產生了某種產黏拮抗作用。經試驗室專業人員感官品評，YNEY-36+MN01組樣品對參照樣感官最相近，均評定為優質酸奶。YNEY-15+MN01和YNEY-28+ MN01組樣品感官品質得分低于參照組，評定為良質酸奶。

根據上述試驗結果，綜合考慮樣品的乳清析出率、黏度、總體感官以及今后可能用于發酵劑開發，試驗最終確定YNEY-36為目標菌株，用于進一步深入研究。

3　結論

試驗從云南省洱源縣鄧川、江尾等地區的乳扇及其酸湯樣中共分離到乳桿菌39株。經試驗篩選，其中3株具有優良的發酵特性，它們分別是YNEY-15、YNEY-28及YNEY-36。經16s rDNA分子鑒定與API50糖發酵試驗相結合，確定YNEY-15為副干酪乳桿菌副干酪亞種3（Lactobacillus paracasei ssp paracasei 3），YNEY-28為植物乳桿菌2（Lactobacillus plantarum 2），YNEY-36為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus）。經菌株組合發酵試驗，最終確定YNEY-36為目標菌株，可用于深入研究和工業發酵的開發。

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Screening and Identification for Lactobacillus from Traditional Dairy Fan Products in Yunnan Province

LI Zhou-yong，CHEN Yun，SHI Yu-dong，YANG Lan，MU Zhi-shen*
（Inner Mongolia Mengniu Dairy Industry（Group）Co.Ltd.R&D Center，Hohhot 011500，Inner Mongolia，China）

Test isolated 39 lactobacillus strains from 20 traditional dairy fan products and sour soup which made by several herding families in Eryuan league of Yunnan province.By test screening，3 lactobacillus with good fermentation characteristics were got，they are YNEY-15，YNEY-28 and YNEY-36.By 16 s rDNA appraisal and API50 sugar fermentation tests，determine the YNEY-15 for Lactobacillus paracasei ssp paracasei 3，YNEY-28 for lactobacillus plantarum 2 and the YNEY-36 for Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus.The mixed fermentation experiment was carried out with three lactobacillus and streptococcus thermophilus，and compared with commercially available yogurt，determine the YNEY-36 for target strains eventually，as the possibility become for yoghurt starter cultures.

fermentation characteristics；lactobacillus；molecular identification；mixed fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.046

李周勇（1987—），男（漢），初級工程師，碩士研究生，研究方向：乳制品研究與開發。
*

母智深，副教授，主要從事乳品營養與工程方面的研究。

2015-04-07