地塞米松對呼吸道合胞病毒感染小鼠肺泡巨噬細胞分化的影響

黃茜，汪理，李曉南

(1.湖北省體育科學研究所，湖北 武漢 430205；2.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院，湖北 武漢 430022；3.華中科技大學醫院 呼吸內科，湖北 武漢 430074)

地塞米松對呼吸道合胞病毒感染小鼠肺泡巨噬細胞分化的影響

黃茜1，汪理2，李曉南3Δ

(1.湖北省體育科學研究所，湖北 武漢 430205；2.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院，湖北 武漢 430022；3.華中科技大學醫院 呼吸內科，湖北 武漢 430074)

目的 觀察地塞米松(dexamethasone,DEX)對小鼠骨髓來源的巨噬細胞(respiratory syncytial virus,BMDM)及呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠的肺泡巨噬細胞分化的影響。方法 體外誘導培養M1型BMDM，鑒定其表型，觀察DEX對巨噬細胞轉錄因子和細胞因子表達的影響；以RSV感染小鼠，同時給予DEX，觀察DEX對小鼠肺泡巨噬細胞轉錄因子和細胞因子表達的影響。結果 DEX能抑制M1型BMDM及RSV感染小鼠的肺泡巨噬細胞中IL-6、IL-12、iNOS和IRF5的表達，并促進IL-10、Arginase-1和IRF4的表達，使M1型巨噬細胞向M2型轉化。結論 DEX可在體內外將M1型巨噬細胞轉化為M2型巨噬細胞，抑制炎癥反應，這可能是DEX治療RSV感染的作用機制之一。

地塞米松；呼吸道合胞病毒；巨噬細胞

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)為副黏病毒科肺炎病毒屬有包膜非節段性的單負鏈RNA病毒，是引起嬰幼兒下呼吸道感染最重要和常見的病毒病原體，可引起急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合癥，并能導致嬰幼兒哮喘的發生[1]。

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，可遞呈抗原啟動免疫應答，還可分泌多種炎癥因子，參與免疫調節。根據活化狀態和發揮功能的不同，巨噬細胞可分為M1型即經典活化的巨噬細胞和M2型巨噬細胞即替代活化的巨噬細胞[2]。 M1型巨噬細胞分泌促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α及iNOS等[3]，高表達IRF5、IRF8等轉錄因子[4-5]，具有較強的抗原提呈能力，參與正向免疫應答；M2型巨噬細胞可表達精氨酸酶1(Arginase-1)、巨噬細胞甘露糖受體(CD206)等[6-7]，高表達IRF4等轉錄因子[8]，抗原提呈能力較弱，還可分泌抑制性細胞因子IL-10、TGF-β等下調免疫應答，促進組織修復和抗炎癥[9]。

肺臟是RSV感染時的主要受累器官，而肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage，AM)是引起肺部炎癥反應的主要效應細胞。研究表明，RSV感染可激活AM，釋放多種炎性介質和細胞因子如IL-12、IL-6、TNF-a等[10-11]，促使白細胞粘附和支氣管痙攣；活化的巨噬細胞還能釋放氧自由基，加重氣道損傷[12]。

糖皮質激素可抑制免疫反應，減輕氣道炎癥反應，而地塞米松(dexamethasone，DEX)是臨床上最為常用的糖皮質激素類免疫抑制劑之一。臨床工作中DEX已被應用于RSV感染后的毛細支氣管炎，但其作用機制尚不明確。巨噬細胞是DEX作用的主要效應細胞，本研究通過觀察地塞米松對小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)及呼吸道合胞病毒感染小鼠的肺泡巨噬細胞分化的影響，探討地塞米松用于RSV感染治療的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及病毒株：50只雌性SPF級BALB/C小鼠購自湖北省疫病預防與控制中心(實驗動物質量合格證編號No.42000600011887)；呼吸道合胞病毒A2株購自中國預防醫學科學院病毒研究所。

1.1.2 主要實驗試劑：Trizol 購自Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒和SYBR Green Supermix購自Bio-Rad公司；兔抗小鼠IRF4和IRF5多克隆抗體購自San Cruz 公司。ECL顯色試劑盒購自Pierce公司。

1.1.3 主要實驗儀器：流式細胞儀(Accuri C6，美國BD)；定量PCR儀(StepOne Plus，美國ABI)；化學發光檢測系統(ES3 Imaging System，美國UVP)。

1.2 方法

1.2.1 M1型小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMDM)的誘導及DEX刺激：處死小鼠，用新潔爾滅浸泡5 min消毒，無菌剝取脛骨和股骨，剪去骨兩端，用DMEM培養液沖洗骨髓腔，用200目無菌尼龍網過濾得到骨髓細胞，加入紅細胞裂解液4 mL裂解紅細胞，PBS洗滌2次，將得到的骨髓細胞用含10%FBS的DMEM制備單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/mL，加入10 cm2的培養皿中，加入粒單核細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)，使其終濃度為50 ng/mL，37 ℃含5%CO2培養箱中培養7 d，第4天更換一次含GM-CSF的培養液。將收獲的巨噬細胞調整細胞濃度至1×106/mL，加入6孔板中，同時加入地塞米松(10-8mol/mL)處理8 h，收獲細胞備用。

1.2.2 M1型BMDM表型的鑒定：收集培養的M1型巨噬細胞，PBS洗2次，調整細胞濃度至1×106/mL，分別加入APC-F4/80、FITC-MHC-II及同型對照抗體，4 ℃孵育30 min，PBS洗2次，流式細胞儀檢測F4/80和MHC-II的表達。

1.2.3 小鼠呼吸道合胞病毒感染模型建立[13]：戊巴比妥鈉0.06 mg/g腹腔注射麻醉小鼠，伸直其頸部，小鼠鼻內滴入106PFU病毒液100 μL，DEX組小鼠在RSV感染第3天腹腔注射DEX 0.2 mg/kg，感染第7天處死小鼠，無菌取小鼠肺泡巨噬細胞用于后續實驗。

1.2.4 小鼠肺泡巨噬細胞的純化：處死小鼠，用新潔爾滅浸泡5 min消毒，沿正中線剪開頸部皮膚，分離氣管，進行支氣管肺泡灌洗，將得到的灌洗液300 g/min離心5 min，棄上清。加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，所得細胞用含10%FBS的DMEM制備單細胞懸液，調整細胞濃度為5×105/mL，加入6孔板培養過夜，換液清除未貼壁的懸浮細胞。

1.2.5 定量PCR檢測小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)及肺泡巨噬細胞中細胞因子的表達：Trizol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。PCR反應依據SYBR Green Supermix說明書進行。參考Genebank序列設計引物，引物序列如下：

IRF-4 上游：5’-CTGCAAGTGTTTGCTCACCA-3’,

下游：5’-GAGTGGTAACGTGTTCAGGT-3’ ；

IL-10 上游：5’-AGTGGAGCAGGTGAAGAGTG-3’，

下游：5’-TTCGGAGAGAGGTACAAACG-3’；

Arginase-1 上游：5’-CAGAAGAATGGAAGAGTCGA-3’，

下游：5’-CAGATATGCAGGGAGTCACC-3’；

IL-6 上游：5’-TCCCCTCCAGGAGCCCAGCTA-3’，

下游：5’-CAGGGCTGAGATGCCGTCGAG-3’；

IL-12 P35 上游：5’-CAGAATCACAACCATCAGCAG-3’，

下游：5’-CACCCTGTTGATGGTCACGAC-3’；

iNOS 上游：5’-AATAGAGGAACATCTGGCCAGG-3’，

下游：5’-ATGGCCGACCTGATGTTGC-3’；

GAPDH 上游：5’-CCTTCCGTGTTCCTACCC-3’，

下游：5’-GCCTGCTTCACCACCTTC-3’

1.2.6 Western blot檢測BMDM及肺泡巨噬細胞中轉錄因子IRF4和IRF5的表達：細胞裂解液裂解細胞，經5%濃縮膠，12%分離膠進行SDS-PAGE電泳。將蛋白條帶電轉移至PVDF膜上，10%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗小鼠IRF-4或IRF-5抗體室溫反應1 h，TBST洗膜4次，每次15 min，再加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，室溫反應1 h，TBST洗膜4次，每次15 min，用ECL底物液顯色。

1.3 統計學方法 以上實驗均重復3次，定量PCR結果由ABI step one PCR擴增儀收集，PCR結束后，進行熔解曲線分析，檢測PCR反應的特異性。使用相對定量方法對擴增反應進行分析，根據擴增曲線得到的Ct值，以2-ΔΔCT進行組間相對分析，采用兩組獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 M1型BMDM表型鑒定 小鼠骨髓細胞誘導分化的M1型巨噬細胞表達F4/80，且高表達MHC-II類分子，證明在體外利用GM-CSF成功誘導得到M1巨噬細胞。

圖1 M1型BMDM表型的鑒定Fig.1 Phenotype identification of M1 BMDM

2.2 DEX對BMDM表達IL-10、IL-12等炎癥因子的影響 與對照組相比，加入DEX刺激M1型BMDM后，IL-10、Arginase-1等免疫抑制因子明顯上升，M2型巨噬細胞轉錄因子IRF4表達也明顯升高，而IL-12、IL-6、iNOS等促炎因子明顯降低。表明DEX能促進M1型BMDM表達IL-10等抑炎因子，抑制其表達IL-12等炎癥因子。

圖2 DEX對BMDM分泌細胞因子的影響*P<0.05Fig.2 Effects of DEX on cytokine secretion of M1 BMDM*P<0.05

2.3 DEX對BMDM表達轉錄因子IRF4和IRF5的影響 Western blot結果顯示：與對照組相比，DEX能明顯抑制BMDM中M1型巨噬細胞轉錄因子IRF5的表達，并能促進M2型巨噬細胞轉錄因子IRF4的表達，表明，DEX能促進BMDM由M1型向M2型轉化。

圖3 DEX對BMDM轉錄因子的影響*P<0.05Fig.3 Effects of DEX on transcriptional factors of M1 BMDM*P<0.05

2.4 DEX對RSV感染小鼠肺泡巨噬細胞中IL-12、IL-10等抑炎因子表達的影響 結果顯示：給RSV感染小鼠注射DEX能促進小鼠肺泡巨噬細胞中IL-10、Arginase-1等免疫抑制因子的表達，M2型巨噬細胞轉錄因子IRF4表達也明顯升高，而注射DEX后肺泡巨噬細胞中內IL-12、IL-6、iNOS等促炎因子明顯降低。表明DEX能抑制RSV感染小鼠肺泡巨噬細胞中IL-12等炎癥因子的表達，促進IL-10等抑炎因子的表達。

圖4 DEX對RSV感染小鼠肺泡巨噬細胞分泌細胞因子的影響*P<0.05Fig.4 Effects of DEX on cytokine secretion of alveolar macrophages in RSV infection mice*P<0.05

2.5 DEX對RSV感染小鼠肺泡巨噬細胞中IRF4、IRF5表達的影響 Western blot 結果顯示：與體外實驗相似，DEX能明顯抑制RSV感染小鼠肺泡巨噬細胞中M1型巨噬細胞轉錄因子IRF5的表達，并能促進M2型巨噬細胞轉錄因子IRF4的表達。表明DEX也能在RSV感染小鼠體內促進巨噬細胞由M1型向M2型轉化。

圖5 DEX對RSV感染小鼠肺泡巨噬細胞轉錄因子的影響*P<0.05Fig.5 Effects of DEX on transcriptional factors of alveolar macrophages in RSV infection mice*P<0.05

3 討論

RSV是嬰幼兒下呼吸道感染的常見病因，嬰幼兒急性RSV下呼吸道感染后常發生反應性氣道疾病，在急性期過后可出現反復喘息癥狀，部分患兒可遷延發展為持續性哮喘。目前臨床上對RSV感染以對癥支持治療為主，主要藥物有糖皮質激素，支氣管擴張劑等。DEX是一種長效糖皮質激素，在急性呼吸窘迫綜合癥、嚴重應激狀態及慢性炎癥性疾病(如類風濕關節炎和支氣管哮喘)中，具有重要的應用價值。

肺泡巨噬細胞廣泛分布于肺泡內及支氣管表面，是肺組織接觸抗原最早、機會最多的免疫細胞，組成肺部防御病原微生物和肺損傷的第一道防線[14]，在病原體入侵時，可釋放大量細胞因子或炎性介質介導急性肺損傷。而巨噬細胞是一種具有可塑性和多能性的細胞群體，在體內外不同的微環境影響下，表現出明顯的功能差異。根據巨噬細胞的表型，通常將其分為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞，不同極化表型的巨噬細胞在宿主抵抗病原微生物、腫瘤免疫、炎癥反應和組織修復等過程中發揮著不同的功能和作用。M1型巨噬細胞表面表達MHC-II、CD11b、CD11c等分子，且高表達誘導性一氧化氮合酶(iNOS)，產生大量一氧化氮(NO)[15]，可殺滅病原微生物，人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)能上調轉錄因子IRF5的表達，促進巨噬細胞吞噬細菌和殺滅腫瘤細胞，調控炎癥因子的表達，進而促進巨噬細胞的M1型極化[16]；M2型巨噬細胞表面表達CD163、CD206、Dectin-1等分子[17]，不產生NO，但高表達精氨酸酶-1(Arginase-1)，Arginase-1代謝生成的鳥氨酸、脯氨酸可以促進膠原合成和組織重構[18]，降低炎癥反應。

本研究利用GM-CSF成功誘導得到高表達MHC-II類分子的M1型BMDM，并用體外實驗證實DEX能促進M1型BMDM向M2型分化。體內實驗進一步研究發現：RSV感染小鼠7 d后，其肺泡巨噬細胞主要表達IL-12、IL-6和iNOS，并高表達IRF5轉錄因子，主要向M1型分化；而注射DEX的小鼠，其肺泡巨噬細胞主要表達IL-10、Arginase-1等，并高表達IRF4轉錄因子，主要向M2型分化。本實驗結果表明，RSV感染后，小鼠肺泡巨噬細胞向M1型分化，促進炎癥反應的發生，應用DEX可將M1型巨噬細胞轉化為M2型巨噬細胞，抑制炎癥反應，這可能是DEX治療RSV感染的作用機制之一，本研究為RSV感染的治療提供了新的思路和啟示。

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(編校：吳茜)

Influence of dexamethasone on alveolar macrophage differentiation in respiratory syncytial virus infected mice

HUANG Qian1, WANG Li2, LI Xiao-nan3Δ

(1.Hubei Research Institute of Sports Science, Wuhan 430205, China; 2.Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China;3.Department of Respiratory Medicine, Hospital of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430074, China)

ObjectiveTo observe the influence of dexamethasone on M1 BMDM and alveolar macrophage differentiation in respiratory syncytial virus (RSV) infected mice. MethodsCulture M1 BMDM and identify its phenotype, observe the effect of DEX on its transcription factors and cytokines; In RSV infected mice, observe the influence of DEX on the transcription factors and cytokines of alveolar macrophage. ResultsDEX can inhibit IL-6, IL-12, iNOS and IRF5 expression, but promote IL-10, Arginase-1 and IRF4 expression in M1 BMDM and alveolar macrophages of RSV infected mice, made M1 macrophages transform to M2 macrophages. ConclusionDEX can transform M1 macrophages to M2 macrophages in vivo and in vitro, and inhibit inflammation, this may be one of the mechanism of DEX in the treatment of RSV infection.

dexamethasone; respiratory syncytial virus; macrophage

湖北省自然科學基金(2015CFB621)

黃茜，女，醫學碩士，研究方向：大眾健康，E-mail：huangqian9816@163.com；李曉南，通信作者，女，醫學學士，副主任醫師，研究方向：呼吸內科感染性疾病的治療，E-mail：19761073@qq.com。

R392.5

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