益生菌制劑對鈣缺乏骨質疏松癥的防治作用

張顏廷 Joerg J.Jacoby,2 王靜* 劉虹 張化朋 王麗春

1.山東鳳凰生物有限公司，泰安 271000； 2.山東寶來利來生物工程股份有限公司，泰安 271000

骨質疏松癥是一種以低骨量和骨組織微細結構破壞為特征，導致骨的脆性和骨折危險性增加的疾病，主要是以為骨骼代謝失衡，骨的再吸收作用大于骨的形成作用[1]。骨質疏松癥是一種多因素引起的慢性疾病，隨著年齡的增長骨質流失而導致骨質疏松癥，這種持續的骨質流失會使骨的吸收與再生越來越慢，骨折的發生率隨之增加[2]。50歲以上的中老年人、絕經后婦女、營養不均衡人群容易患骨質疏松癥。目前對于骨質疏松的治療藥物一般主要有鈣制劑、維生素D和鈣的復合制劑和抗骨吸收藥及激素等藥物，但是由于藥物及激素的長期服用，其副作用也逐漸突顯。最近研究發現，維生素K2具有促進骨形成，防治骨質疏松癥的作用[3,4]。自1995年日本首次批準維生素K2作為骨質疏松治療用藥以來, 其療效及藥用安全性得到了廣泛而深入的研究和認可，但是由于由于其從發酵的納豆中提取，來源有限且價格昂貴，并未普及[5]，且目前關于含維生素K2的益生菌制劑治療骨質疏松的研究報道較少。本研究以鈣攝入不足引起骨質疏松的大鼠為試驗對象，利用自主研發的高產維生素K2(MK-7)的益生菌粉，配伍VD2及Ga等成分，探討益生菌制劑對骨質疏松的作用。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

戊巴比妥鈉，Merck P11011；大鼠羧化不全骨鈣素(ucOC)檢測試劑盒，上海酶聯生物研究所；大鼠羧化骨鈣素(cOC)檢測試劑盒，上海酶聯生物研究所；鈣，鄭州瑞普生物工程有限公司；維生素D，廣州利源食品添加劑有限公司；低鈣飼料購于北京科奧協力飼料有限公司；維生素K2(MK-7)益生菌粉為山東寶來利來公司生產。

1.2 儀器

美國好樂杰(Hologic)雙能X線骨密度儀

1.3 試驗動物與分組

清潔級雌性SD大鼠32只，體重220 g～250 g，隨機分為4組，每組8只。分籠飼養，室溫20～25℃，相對濕度40%～60%，自由飲水。將大鼠分為普通飼料飼喂組(對照組)、低鈣飼料飼喂組(模型組)、低劑量復配產品治療組(C1組)、高劑量復配產品治療組(C2組)，C1組和C2組產品成分包括維生素K2(MK-7)的益生菌粉、VD2及Ga等。

對照組在實驗過程中飼喂普通飼料，自由飲水。模型組、C1組、C2組同時飼喂低鈣飼料。飼喂低鈣飼料三周后，C1組、C2組給予產品治療，C1組給予低劑量維生素K2(MK7)的益生菌粉(MK7劑量8.31ug/d.bw)+VD2(1.6ug/d.bw)+鈣(80 mg/d)，C2組給予高劑量維生素K2(MK-7)的益生菌粉(MK-7劑量83.1ug/d.bw)+VD2(16ug/d.bw)+鈣(80 mg/d)。通過灌胃的形式給藥，給藥時間為3周。每周稱體重一次，根據體重調整灌胃量。

1.4 試驗方法

實驗開始前及實驗結束后，用30 mg/mL戊巴比妥鈉25 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，用雙能X射線測定儀(DEXA)測定大鼠骨密度(BMD)及骨礦含量(BMC)，并計算△BMC和△BMD，△BMC為試驗結束后大鼠的BMC值與試驗開始時大鼠的BMC值的差值，△BMD為試驗結束后大鼠的BMC值與試驗開始時大鼠的BMC值的差值。實驗結束后，完成DEXA測定時，對大鼠心臟取血，測定大鼠血清中羧化不完全骨鈣素(ucOC)及羧化完全骨鈣素(cOC)含量，計算ucOC/cOC值。

1.5 相關指標檢測

美國好樂杰(Hologic)雙能X線骨密度儀測定大鼠骨組織參數：BMC：骨礦物質含量，BMD：骨密度。

ELISA法測定ucOC及cOC水平：使用大鼠羧化不全骨鈣素(ucOC)檢測試劑盒測定血清中ucOC水平，使用大鼠羧化完全骨鈣素(cOC)檢測試劑盒測定血清中cOC水平。

1.6 數據分析

2 結果與分析

2.1 大鼠體重變化

在實驗三周后，對照組、模型組、C1組、C2組大鼠的體重較試驗開始時顯著增加(P<0.05)，在試驗后3周，灌胃產品的C1組、C2組大鼠的體重與對照組的大鼠的體重呈增加的趨勢，而模型組大鼠體重無明顯變化(P>0.05)。

圖1 大鼠體重變化Fig.1 The change of weight in rats

2.2 骨礦含量測定結果

在飼喂6周后，與對照組相比，模型組、C1組、C2組的BMC值顯著降低(P<0.05)。實驗前后各組大鼠BMC值都有一定程度的增加，C1組與C2組增加量要顯著高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 骨密度測定結果

與對照組相比，模型組、C1組、C2組大鼠的BMD顯著降低(P<0.05)，在飼喂低鈣飼料6周后，模型組大鼠骨密度要顯著低于對照組(P<0.01)，并且要比飼喂之前低。后期灌胃產品的C1組、C2組大鼠骨密度要顯著高于模型組(P<0.05)，且骨密度有一定的增加，增加量相對于模型組顯著，具有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠骨密度值變化Table 1 The change of BMD in rats of each group

注：對照組：正常飼喂組；模型組：飼喂低鈣飼料組；C1組：低劑量產品灌胃組；C2組：高劑量產品灌胃組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05
Note: Control group-Normal feeding; Model group-Low calcium group;C1-Low dose probiotics group; C2-High dose probiotics group;*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs Model group

2.4 ucOC/cOC值

給予產品三周后，與對照組相比，模型組、C1組、C2組大鼠的ucOC/cOC值差異不顯著(P>0.05)。而C1組、C2組大鼠的ucOC/cOC值顯著低于模型組，具有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠ucOC/cOC值Table 2 The result of ucOC/cOC in rats of each group

注：對照組：正常飼喂組；模型組：飼喂低鈣飼料組；C1組：低劑量產品灌胃組；C2組：高劑量產品灌胃組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05
Note: Control group-Normal feeding; Model group-Low calcium group;C1-Low dose probiotics group; C2-High dose probiotics group;*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs Model group

3 討論

研究表明，長期的低鈣飲食使人體鈣吸收減少，能夠導致骨質疏松癥[6,7]。有研究顯示，成年動物鈣攝入量少時，會導致骨松動，最終形成骨質疏松[8]。本研究發現，連續飼喂低鈣飼料6周時，大鼠的骨礦含量及骨密度要顯著低于正常飼喂組，即長期的鈣缺失能夠導致大鼠骨質疏松。

眾所周知攝入充足的鈣可以保證骨骼的健康成長并可以預防骨質流失。研究表明維生素D能促進鈣被人體有效的吸收，將“腸鈣”轉化為“血鈣”[9]。但是，該補充也有兩面性，當鈣攝入量過多，MGP濃度較低時，鈣不能被人體有效利用，會出現血管等的鈣化，引發一系列的心血管疾病[10]。研究表明，維生素K，特別是維生素K2(MK-7)能維持機體內鈣的平衡，將“血鈣”轉化為“骨鈣”[9]。2004年Liman Sun等人研究也表明活性VD3和VK2可以抑制蛋白質缺乏導致的骨質疏松[11]。陳鵬等的研究也發現維生素K2配伍維生素D3和檸檬酸鈣具有明顯增加骨密度和骨鈣的作用[12]。本研究結果也發現灌胃產品組BMC與BMD值顯著高于模型對照組，說明當維生素K2、維生素D以及鈣同時存在時，具有提高骨礦含量，增強骨密度的作用，即含天然維生素K2的益生菌制劑能夠有效地防治鈣攝入不足引發的骨質疏松。

OC是血清骨鈣蛋白，是骨形成和骨轉換的標志，具有維生素K依賴性，可形成羧化完全骨鈣素(cOC)，cOC能夠轉運血液中的鈣到骨骼中，具有維持骨礦化速率、抑制軟骨礦化速率等的作用。當維生素K不足時，OC不能完全羧化，形成羧化不完全骨鈣素(ucOC)。研究表明，椎骨骨折的病人體內ucOC水平明顯高于非骨折病人，當ucOC/cOC比率升高時，即說明了維生素K的缺乏同時也說明骨骼具有骨質疏松的風險[13]。最近研究發現，維生素K2是必不可少的骨代謝調節劑，能刺激成骨細胞的作用，促進骨形成[14,15]。Je SH等[16]研究顯示聯合應用維生素K2、維生素D和鈣可減少ucOC的血液濃度。Hirao M[17]等研究顯示維生素K2可促進骨鈣素的羧化，形成cOC，增加股骨和頸骨密度。本試驗結果表明，與模型組相比，灌胃復配產品組ucOC/cOC值顯著降低，說明灌胃產品中補充的維生素K2能有效的被大鼠吸收，促進骨鈣素的羧化，進而促進鈣的有效利用，提高骨礦含量，降低其骨質疏松的風險。

本試驗研究表明含有維生素K2的益生菌粉與維生素D和鈣復配之后，能夠有效的被大鼠吸收利用，達到防治骨質疏松的目的。