小鼠游泳耐力實驗系統的建立與紅景天抗疲勞作用的驗證

謝　磊，李　由，劉新民，陳善廣，王克柱，陳怡西，王　瓊

(1.四川醫科大學，四川 瀘州　646000；2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京　100193；3.中國航天員科研訓練中心人因工程重點實驗室，北京　100094)

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小鼠游泳耐力實驗系統的建立與紅景天抗疲勞作用的驗證

謝磊1,2，李由3，劉新民2，陳善廣3，王克柱2，陳怡西1，王瓊1

(1.四川醫科大學，四川 瀘州646000；2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京100193；3.中國航天員科研訓練中心人因工程重點實驗室，北京100094)

目的建立小鼠游泳耐力實驗系統，挖掘評價小鼠游泳耐力的新指標，并用此系統驗證紅景天對小鼠耐力的影響。方法將計算機視頻采集技術和圖像分析技術應用于小鼠游泳耐力實驗中，實時獲取小鼠游泳信息，提取包括力竭時間、首次下沉時間、下沉總時間、首次連續下沉時間在內的多個耐力評價指標，客觀精確地在線分析小鼠耐力數據；利用正常小鼠、紅景天給藥小鼠對系統的穩定性、可靠性進行實驗研究。結果計算機記錄數據與人工記錄數據具有高度相關性，r>0.95,系統穩定可靠。首次連續下沉時間與力竭時間的相關性系數r=0.974，其他新指標與力竭時間的相關性系數r<0.9。紅景天給藥組較空白組，首次下沉時間和首次連續下沉時間顯著性增加。結論該系統用于評價小鼠游泳耐力的指標客觀、精確、靈敏，實現了視頻采集、信息整合、數據分析、統計輸出一體化，尋找到了與力竭時間高度相關的新指標-首次連續下沉時間。全套系統自動化、智能化程度高，為抗疲勞藥物的篩選提供了一套可靠的實驗系統。

小鼠；力竭游泳；計算機；紅景天

隨著社會競爭壓力的增加，各類急性疲勞、慢性疲勞綜合癥已成為嚴重影響人類工作、生活的社會性問題。近年來有關西藥抗疲勞藥物研究報道較少且副作用大[1]，因此，從中藥中尋找有效的抗疲勞成分已成為抗疲勞藥物研究的熱點。目前國內外用于抗疲勞藥物研究的行為學方法主要包括負重游泳實驗、強迫游泳實驗、跑臺實驗、轉棒實驗等[2-4]，其中最為經典的是負重游泳實驗[5]，該實驗方法對動物心理應激小、生理傷害少，從而被廣泛使用。

然而現階段大量的負重游泳實驗方法多為人工記錄，自動化程度低、結果可靠性差，測試中獲得的信息量少、檢測環境不穩定(水溫需人工調節)、動物之間相互干擾(多只動物同時檢測，出現身體碰撞、相互蹬踏等不可避免的干擾因素)，導致實驗重復性差[6]。研究自動化程度高、更為科學客觀的負重游泳實驗系統，挖掘能更好評價小鼠游泳耐力的新指標是現在科研工作者急需解決的問題。因此，本研究結合計算機視頻采集技術和圖像分析技術，旨在構建一套小鼠游泳耐力實驗系統并評價疲勞相關的行為學指標，為抗疲勞藥物的研究提供科學、客觀的實驗方法。

1　材料和方法

1.1儀器

計算機主機(Pentium 3.2 GHz，內存2.00 GB，硬盤 500 G)、攝像機(VS-250DH，分辨率752*582，)、鏡頭(AFT-VS0410ZM)，圖像采集卡(維視MV-E8800，總線數據傳輸速率250MByte/S，10bit AD轉換芯片)、顯示器(Dell 17寸顯示器，分辨率1280*1024)、負重游泳測試缸及附屬配件、恒溫裝置(享庭X-218加熱棒，功率1000w)、負重游泳測試桶。

1.2實驗動物與材料

1.2.1實驗動物

雄性ICR小鼠，SPF級，購自北京維通利華實驗動物有限公司【SCXK(京)2012-0001】。給藥期間喂養于實驗室動物房，實驗室溫度恒定保持25℃，12h照明/12h黑暗環境(8：00 am開燈，20:00 pm 關燈)，動物自由飲食飲水。動物實驗在協和藥用植物研究所動物房進行【SYXK(京)2013-0023】，并按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2.2材料

央科藏域紅景天膠囊：購自西藏央科生物科技有限公司，生產日期：20140410，生產批號：140401

羧甲基纖維素鈉300～800 mPa·s：購自國藥集團化學試劑有限公司。

鉛皮：漁具店購買。

1.3小鼠游泳耐力實驗系統的建立

1.3.1硬件的研制

硬件包括測試缸，及測試缸內的測試桶(2個)、加熱裝置、LED燈和測試缸外的主支架、相機支架、亞格力透光板、攝像機(2個)、LED背景燈控制器、視頻采集卡和計算機。采用全開放式缸體設計，單一測試缸尺寸750×350×400 mm (長×寬×高)的組合式長方體超白玻璃缸，內含兩個平行放置的有機玻璃桶。實驗桶尺寸為250×300 mm (直徑×高)，右側壁板上安置加熱裝置一套。缸外頂部和前部安置有攝像裝置，攝像裝置分別通過各自相機支架固定于主支架的頂部和前部。缸外底部和后部有與攝像裝置相對應的紅色LED背景燈，LED背景燈與缸體之間間隔一層亞格力透光板，LED背景燈外側有主支架，主支架對測試缸及其他結構起支撐作用。硬件結構如圖1。

圖1　小鼠游泳耐力實驗系統結構圖Fig.1　Diagram of swimming endurance system in mice

1.3.2軟件的研制

軟件系統采用MIcrosoft Visual C++ 6.0語言開發環境，運行于XP操作系統，設置實驗項目、實驗參數、實驗操控、數據輸出4大功能模塊。設定包括力竭模式、下沉次數模式和下沉總時間模式等3種不同的實驗模式。軟件可提取的耐力指標包括：1)力竭時間(exhaustive time, ET)，動物從開始檢測至全部軀干浸入水下超過7 s計算機所記錄的游泳時間；2)首次下沉時間(first sink time, FST)，動物從開始檢測至首次全部軀干浸入水下計算機所記錄的游泳時間；3)下沉總時間(total sink time, TST)，動物從開始檢測至力竭期間或指定時間點下沉時間的總和；4)下沉次數(sink frequency, SF)，動物從開始檢測至力竭期間或指定時間點下沉次數的總和；5)首次連續下沉時間(continuous sink time, CST)：動物從開始檢測至7 s內連續出現2次或以上的下沉行為計算機所記錄的游泳時間。軟件界面圖見圖2。

圖2　小鼠游泳耐力實驗系統軟件界面圖Fig.2　software interface of swimming endurance system in mice

1.4系統驗證

1.4.1指標可靠性驗證

1.4.2小鼠游泳耐力實驗系統的應用

2　結果

2.1指標相關性驗證

結果顯示，ET、FST、TST、SF、CST計算機記錄值與人工記錄值均高度相關，除TST的人機相關系數r=0.96，其余4個指標的人機相關系數均>0.99,也進一步驗證了下沉閾值(=0.5 s)的可靠性(表1)。

2.2新指標與經典指標(ET)相關性分析

結果顯示，TST與ET間相關性最低(r=0.043)，CST與ET間的相關性最高(r=0.974)，SF與ET間相關性較低(r=0.16)，FST與ET間相關性較高(r=0.771)。分段后各時刻得到的下沉次數、下沉總時間分別與力竭時間進行相關性分析所得到的相關性系數均較力竭時刻的下沉次數、下沉總時間的相關性系數高，且所取時刻越大，相關性越高。提示下沉次數和下沉總時間兩個指標在實驗數據分析時應在固定游泳時間下進行分析。結果如表2、表3、表4。

方法(Methods)力竭時間(Exhaustivetime,ET)(s)首次下沉時間(Firstsinktime,FST)(s)下沉次數(Sinkfrequency,SF)(次)下沉總時間(Totalsinktime,TST)(s)首次連續下沉時間(Continuoussinktime,CST)(s)人工記錄(Manualrecord)490.1±199.8317.6±169.412.1±6.833.7±14.6426.7±212.6計算機記錄(Computerrecord)490.6±200.0317.0±170.012.4±7.234.4±14.7426.7±212.5相關性系數(Pearsonvalue)>0.99>0.99>0.99=0.96>0.99

新指標(Newindexes)首次下沉時間(Firstsinktime,FST)(s)下沉次數(Sinkfrequency,SF)(次)下沉總時間(Totalsinktime,TST)(s)首次連續下沉時間(Continuoussinktime,CST)(s)新指標值(ValueofNewindexes)317.6±169.412.1±6.833.7±14.6426.7±212.6力竭時間(Exhaustivetime,ET)(s)490.1±199.8490.1±199.8490.1±199.8490.1±199.8相關性系數(Pearsonvalue)0.7710.160.0430.974

表3小鼠游泳耐力實驗系統分時段下沉次數(次)與力竭時間(s)相關性分析(x±s,n=20)

分段下沉次數(Paragraphofsinkfrequency)150s下沉次數(Sinkfrequencyof150s)200s下沉次數(Sinkfrequencyof200s)250s下沉次數(Sinkfrequencyof250s)分段值(ValueoftheParagraphs)0.6±1.571.0±2.431.95±3.36力竭時間(Exhaustivetime,ET)490.1±199.8490.1±199.8490.1±199.8相關性系數(Pearsonvalue)0.420.4420.596

分段下沉總時間(Paragraphoftotalsinktime)150s下沉總時間(Totalsinktimeof150s)200s下沉總時間(Totalsinktimeof200s)250s下沉總時間(Totalsinktimeof250s)分段值(ValueoftheParagraphs)1.06±2.972.34±7.44.03±8.89力竭時間(Exhaustivetime,ET)490.1±199.8490.1±199.8490.1±199.8相關性系數(Pearsonvalue)0.4110.3930.525

2.3紅景天對小鼠耐力的研究

結果顯示，紅景天能明顯增加ICR小鼠游泳耐力，ICR雄性小鼠經14 d灌胃后，體重與空白組比較無顯著性差異，表現出首次下沉時間、首次連續下沉時間兩項指標顯著性(P<0.05)增加，力竭時間也有很大增加(P=0.057)。

時間Date(d)空白組(Controlgroup)紅景天組(Integripetalrhodiolaherbgroup)126.58±1.5228.22±1.51429.54±1.2229.35±1.34730.20±1.4530.35±1.511031.18±1.2931.22±1.651431.45±1.2831.80±1.65

指標(Indexes)力竭時間(Exhaustivetime,ET)(s)首次下沉時間(Firstsinktime,FST)(s)下沉次數(Sinkfrequency,SF)(次)下沉總時間(Totalsinktime,TST)(s)首次連續下沉時間(Continuoussinktime,CST)(s)空白對照組(Controlgroup)717.9±277.4439.9±190.220.1±17.751.9±33.7612.3±238.1紅景天組(Integripetalrhodiolaherbgroup)1179.4±601.3798.0±310.135.6±32.570.1±66.1984.5±455.9兩樣本t檢驗值(ValuesofIndependent-SamplesTtests)0.0570.0060.2020.4470.034

3　討論

力竭游泳實驗是臨床前實驗中評價小動物耐力的經典實驗方法[11]。王艷杰等[12]采用透光材質將動物分區實驗，解決了動物在實驗過程中相互干擾的問題，但仍采用人工記錄數據的實驗方法；張衛華等[13]研制的動物游泳實驗視頻觀察儀器，解決了力竭實驗過程中出現的圖像失真，動物位置偏好等問題，可獲得漂浮時間、游泳時間、力竭時間三個指標；莊成樂等[14]研制的大小鼠力竭游泳裝置采用在大小鼠口鼻尖放置傳感器來判定動物下沉行為，獲得動物下沉總時間10 s的時刻。本課題采用同一軟件系統下，同時捕獲4只動物在不同游泳桶內的二維活動，既避免了動物的相互干擾，又更準確提取了動物下沉行為信息，測試樣本量也增加四倍。該系統設計的“小鼠力竭游泳實時監測軟件”在現有指標下，增加了首次下沉時間、下沉次數、下沉總時間、首次連續下沉時間，還可提取分時段的下沉次數及分時段的下沉總時間。經過數百次實驗驗證，這些指標穩定可靠，與經典的力竭時間指標有很好的相關性。

研究表明，力竭時間是經典的負重游泳耐力評價指標，但動物力竭后生理及心理應激反應強烈，與動物倫理及福利相違背[15]。龔夢娟等[5]研制出一套小鼠游泳計算機自動控制與圖像分析處理系統，首次提出了首次下沉時間的概念。因此，本課題致力于挖掘與力竭時間高度相關的耐力評價新指標，以多角度、小應激、低死亡、高精度為目的評價小鼠游泳耐力強弱。結果顯示，首次連續下沉時間與力竭時間相關性最高，且出現時間更早，提示在實驗動物較少或者負重游泳測試后需進行生化指標測定等的實驗，可用首次連續下沉時間代替力竭時間來對實驗進行評價。此外，劉靜波等人研究指出，影響負重游泳的最大因素為游泳水溫[16]，利用本系統的恒溫裝置可將水溫恒定在25±1℃，大大減少了實驗的變量，保證了實驗環境的穩定。經前期研究證明，體重對負重游泳實驗影響較大，相對較重的體重在進行力竭游泳測試時，各指標的數據分布更集中，標準差更小。因此，推薦力竭游泳實驗測試時盡量選用大周齡小鼠(w>7)，但購入動物不能超過4周齡，以免動物發生同籠廝打行為。

《四部醫典》曾著紅景天，其性平、味澀、善潤肺、能補腎、理氣養血。主治周身乏力、胸悶、惡心、體虛等癥。耿欣等[17]報道，紅景天具有顯著的抗疲勞、抗輻射功能，韓雪嬌，郭娜等[18]進一步證實了紅景天中紅景天苷的抗疲勞作用。本課題利用紅景天的抗疲勞作用，再次驗證了小鼠游泳耐力實驗系統的可靠性。

本研究采用更完整的硬件設計，建立的小鼠游泳耐力實驗系統，不僅有效避免了動物間的相互干擾，還能準確判斷動物的下沉相關指標，同時溫度自動控制，且檢測樣本量增加。開發的小鼠游泳耐力實驗軟件系統，不僅穩定可靠，還提取了與經典指標相關性高的新指標。全套系統自動化、智能化程度高，為抗疲勞藥物的篩選提供了一套可靠的實驗系統。

[1]徐志剛. 抗疲勞藥物的研究進展[J]. 海峽藥學，2012，01：21-23.

[2]Matsumoto K, Ishihara K, Tanaka K,etal. An adjustable-current swimming pool for the evaluation of endurance capacity of mice[J]. Journal of Applied Physiology, 1996, 81(4):1843-1849.

[3]Billat V L, Mouisel E, Roblot N,etal. Inter-and intrastrain variation in mouse critical running speed[J]. Journal of Applied Physiology, 2005, 98(4): 1258-1263.

[4]馬挺軍，徐藝青. 西伯利亞白刺籽油的抗疲勞活性[J]. 中國實驗動物學報，2012，20(5)：77-79.

[5]龔夢鵑，張煜. 基于小鼠游泳計算機自動控制系統的抗疲勞指標評價體系的建立[J]. 遼寧中醫藥大學學報，2010，12：59-61.

[6]鐘雨，閆明珠，張澤生，等. 黃秋葵水提物抗運動疲勞作用研究[J]. 食品科技，2015，01：171-175.

[7]Zhang H, Liu Y, Zhou J,etal. Amylopectin is the anti-fatigue ingredient in glutinous rice[J]. International journal of biological macromolecules, 2014, 63: 240-243.

[8]Wang L, Zhang H L, Lu R,etal. The decapeptide CMS001 enhances swimming endurance in mice[J]. Peptides, 2008, 29(7): 1176-1182.

[9]王瓊，買文麗，李翊華，等. 自主活動實時測試分析處理系統的建立與開心散安神鎮靜作用驗證[J]. 中草藥，2009，11：1773-1779.

[10]馬莉.紅景天苷抗疲勞作用及其機制的實驗研究[D]. 第二軍醫大學，2006.

[11]何來英，嚴衛星，樓密密，等. 保健食品抗疲勞作用試驗方法研究[J]. 中國食品衛生雜志，1997，04：3-8+26+48.

[12]王艷杰，劉慧慧，馮曉帆，等. 一種強迫小動物游泳實驗裝置[P]. 遼寧：CN203399599U，2014-01-22.

[13]張衛華，徐國標，黃坤，等. 動物游泳實驗視頻觀察儀器[P]. 四川：CN202026685U，2011-11-09.

[14]莊成樂，陳帆風，黃冬冬，等. 一種專用于大小鼠力竭游泳實驗的設備[P]. 浙江：CN204520726U，2015-08-05.

[15]金玫蕾. 我國實驗動物科學帶來的動物倫理及福利問題[J]. 生命科學，2012，11：1325-1329.

[16]劉靜波，林松毅. 以負重游泳動物試驗評價抗疲勞作用的影響因素分析[J]. 食品科學，2005，08：399-403.

[17]耿欣. 紅景天抗疲勞作用研究進展[J]. 中醫藥學報，2011，03：95-97.

[18]韓雪嬌，郭娜，朱美宣，等. 紅景天苷藥理作用及其作用機理研究進展[J]. 中國生化藥物雜志，2015，01：171-175.

Establishment of the swimming endurance system in mice and the verification of the anti-fatigue effect in hongjingtian

XIE Lei1,2, LI You3, LIU Xin-min2, CHEN Shan-guang3,WANG Ke-zhu2, CHEN Yi-xi1, WANG Qiong1

(1.Sichuan Medical University, Luzhou 646000, China; 2.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China;3.National Key Laboratory of Human Factors Engineering, China Astronaut Research and Training Center, Beijing 100094, China)

ObjectiveTo establish a swimming endurance system, excavating new indexes evaluating the swim capacity in mice and detecting the effects of HONGJINGTIAN (HJT) capsule on the swimming capacity in mice. Methods Combining video capture technology with image analysis technology into the Exhaustive swimming test, this system would automatically collect and objectively analyze the data when the swimming behavior perform synchronously in mice. A series of indexes would be calculated, such as Exhaustive time, First sink time, Total sink time, Sink frequency, Continuous sink time. Furthermore, the classical anti-fatigue herb named HJT will use to detect the stability and reliability of this swimming endurance system. Results The data showed high correlation between the computer and manual record (r>0.95), indicating high stability and reliability of the swimming endurance system. The continuous sink time (CST) have been proved out high correlation with Exhaustive time(ET) (r=0.974), while the correlation of others indexes less than 0.9. The mice treated with HJT by intragastric administration had showed significantly increase in the First sink time (FST) and the Continuous sink time (CST) compared with the control group. ConclusionsThe results showed that the system could assess swimming capacity objectively, precisely and sensitively in mice. In addition, this system realized integrating video capture, data analysis and data output together automatically. Besides, a new index-CST was found to be high correlation with ET. This system turn out to be high automatically and intelligently, and provide a reliable system to screen the potential anti-fatigue drugs.

Mice; Exhaustive swimming; Computer; Hongjingtian

人因工程重點實驗室開放基金資助項目(HF2012-K-01,HF2012-K-06)；國家科技重大專項(2012ZX09J12201)；四川省科技廳-瀘州市人民政府-瀘州醫學院聯合科研資金項目(14JC01323-LH50)。

謝磊(1990-)，男，碩士生，研究方向：中藥神經精神藥理，E-mail:296303836@qq.com。

王瓊，女，博士生導師，E-mail:wqimplad@126.com；劉新民，男，博士生導師，E-mail:liuxinmin@hotmail.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0071-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.011

2016-02-24