烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑干預對慢性不可預知應激大鼠模型抗抑郁作用及機制的研究

劉曉萌，張　榮，董世芬，程工倪，暢洪昇，孫建寧

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京　100102；2.中國食品藥品檢定研究院 國家藥物安全評價監(jiān)測中心，北京　100176)

L. on monoamine neurotransmitters concentration in hippocampus in CUS ±s)

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烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑干預對慢性不可預知應激大鼠模型抗抑郁作用及機制的研究

劉曉萌1,2，張榮1，董世芬1，程工倪1，暢洪昇1，孫建寧1

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京100102；2.中國食品藥品檢定研究院 國家藥物安全評價監(jiān)測中心，北京100176)

目的觀察烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑對慢性不可預知應激大鼠行為學、下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能以及海馬組織單胺類神經(jīng)遞質含量的影響。方法選取SD大鼠72只，隨機分為正常對照組、應激模型組、氟西汀組、烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑(高、中、低劑量)組，給藥28 d，實驗結束時對各組大鼠進行糖水消耗實驗、Morris水迷宮實驗監(jiān)測，采用放免法檢測血清皮質酮(CORT)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)的濃度，高效液相-電化學法檢測海馬中5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)以及多巴胺(DA)的含量。結果與正常對照組相比，模型組大鼠造模4周后，糖水偏嗜度明顯降低，Morris水迷宮實驗中大鼠逃避潛伏期延長、在目標象限的時間及總路程減少(P< 0.05)；血液指標顯示，模型組大鼠血清中的ACTH、CORT、CRH含量明顯升高，海馬組織單胺神經(jīng)遞質5-HT、NE和DA的含量明顯降低(P< 0.05)。與模型組相比，烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑490 mg/kg，245 mg/kg劑量組可顯著升高模型組大鼠糖水偏嗜度，縮短大鼠逃避潛伏期，增加大鼠在目標象限的時間及總路程(P< 0.05，P< 0.01)。還可顯著降低模型大鼠血清中ACTH、CORT、CRH含量，升高海馬組織5-HT，NE和DA的含量(P<0.05)。結論烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑具有一定的抗抑郁作用，其機制可能與增加海馬組織中5-HT、DA、NE的含量，改善應激刺激導致的HPA軸功能紊亂狀態(tài)有關。

烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑；慢性不可預知應激；抗抑郁；下丘腦-垂體-腎上腺軸；單胺類神經(jīng)遞質

抑郁癥是一種情感性精神疾病，其發(fā)病機制與神經(jīng)遞質失調(diào)、內(nèi)分泌功能紊亂以及大腦功能異常等有著密切的關系。臨床上首選抗抑郁藥物多以增加突觸單胺類神經(jīng)遞質5-HT、NE、DA的含量為主，但是這些藥物的起效時間緩慢，副作用多[1]。因此開發(fā)新型、高效、低毒副作用的抗抑郁中藥制劑是近年來研究的熱點。烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑是由烏靈菌粉和貫葉連翹提取物組成，烏靈參菌粉具有明顯調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的作用，臨床常用于改善失眠、衰弱、焦慮、社交障礙等，其主要含有蛋白質、多糖、無機元素、維生素及腺苷類等化學成分；貫葉連翹又稱之為圣約翰草，是英國皇家藥典委員會鄭重推薦治療抑郁癥的首選植物藥，被世界衛(wèi)生組織評定為“植物藥之星”，主要含有：貫葉金絲桃素類化合物，黃酮類化合物及苯并二蒽酮類化合物等。本課題采用慢性不可預知應激與孤養(yǎng)相結合的方法建立抑郁模型，觀察烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑對該模型大鼠海馬組織單胺類神經(jīng)遞質以及下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響，探討其抗抑郁作用機制。

1　材料和方法

1.1實驗動物

SPF級SD大鼠，72只，雄性，體重250～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】，實驗室使用許可證號【SYXK(京)2011～0024】，室溫為(23±2)℃，相對濕度為(65±5)%，實驗前動物適應性飼養(yǎng)1周，自由攝取食水。

1.2藥品與試劑

受試藥物：烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑，褐色粉末，浙江佐力公司提供，臨床人用量為2.1 g/60 kg，大鼠受試劑量根據(jù)臨床人用量分別設為490 mg/kg，245 mg/kg，123 mg/kg，其中245 mg/kg為臨床等效劑量；陽性對照藥：鹽酸氟西汀，PATHEONF RANCE有限公司，批號A078877，大鼠給藥劑量為2.4 mg/kg。上述藥物臨用時以去離子水配成所需濃度的溶液，均灌胃(i.g.)給藥。

血清皮質酮(CORT)放免試劑盒，美國Los Angles CA試劑公司；促腎上腺皮質激素(ACTH)放免藥盒，促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)放免藥盒，北京華英生物技術研究所產(chǎn)品。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)，去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)，多巴胺(dopamine，DA)，以上試劑為標品，僅供含量測定用；均購自SIGMA公司。甲醇為色譜純(Thermo Fisher Scientific，USA)，其他試劑為分析純。

1.3主要儀器

R-911全自動放射免疫計數(shù)器，中國科技大學實業(yè)總公司；ESA 高效液相色譜儀，Model coulochem Ⅲ電化學檢測器，Model 582 Pump(solvent delivery system)，C18色譜柱(5 μm，3.2 mm×150 mm)。循環(huán)水式多用真空泵，Heraeus Fresco 21高速冷凍離心機，pHS-3B精密pH計，JA1103N分析天平，小動物行為分析系統(tǒng)(Ethovision XT 9)，Morris水迷宮(Morris water maze)。

1.4動物分組及給藥

大鼠置于自然晝夜節(jié)律光照條件下，適應性飼養(yǎng)1周，6只/籠。1周后根據(jù)體重隨機分為正常對照組、應激模型組，模型+鹽酸氟西汀組(2.4 mg/kg)，模型+烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑高、中、低劑量組(490 mg/kg、245 mg/kg、123 mg/kg)，實驗期間正常對照組大鼠6只/籠，模型組及各給藥組大鼠均單籠飼養(yǎng)。造模同時給藥，給藥體積10 mL/kg，每日一次，連續(xù)給藥28 d。

1.5動物模型的建立

根據(jù)Willner的應激方法稍作改動。應激方法如下：電擊足底(36 V，頻率0.1 Hz，每次持續(xù)10 s，共20次)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、噪音刺激(2 h)、夾尾(1 min)、熱應激(45 ℃，5 min)、制動(8 h)、晝夜顛倒(24 h)、冰水游泳(4℃，5 min)。除對照組外，應激組大鼠每天被迫接受應激，每日1種應激，連續(xù)處理28 d。于實驗前隨機抽取每日刺激方式，避免同一種應激方式連續(xù)使用。

1.6行為學檢測

1.6.1糖水消耗實驗

開始造模前1周對大鼠進行1%糖水偏好訓練。于造模開始前進行第1次糖水偏好度測試。糖水偏好訓練和測試均于大鼠禁水22 h后，測定2 h內(nèi)飲用量(中途1 h時交換瓶子位置)。計算糖水偏嗜度，計算公式如下：

糖水偏嗜度(%)=糖水消耗/總液體消耗×100%。

1.6.2水迷宮實驗

各組動物模型及灌胃結束后，次日進行Morris水迷宮。(1)定位航行實驗(place navigation test)將水迷宮分為均等的4個象限，逃逸平臺置于象限Ⅳ的中央，水深 50 cm(平臺沒于水下2 cm)，以其他3個象限迷宮壁中點為大鼠落水點，實驗期間迷宮周圍環(huán)境始終不變。大鼠入水時面對迷宮壁，觀察并記錄90 s內(nèi)大鼠找到平臺(要求大鼠找到平臺并在平臺上停留5 s以上)的時間，即逃避潛伏期(escape latency)，若90 s內(nèi)未找到平臺，則以90 s計。每次實驗結束后讓大鼠在平臺上停留15 s(若大鼠在90 s內(nèi)未能找到平臺，則引導其爬上平臺)以產(chǎn)生并加強記憶。依次從不同象限的入水點入水，每天訓練1次，連續(xù)訓練7 d。(2)空間探索實驗(spatial probe test)第8天撤除水中平臺，將大鼠自距原平臺最遠的象限(象限Ⅱ)放入水中，觀察并記錄在第Ⅳ象限(目標象限)運動的總路程和時間(時限90 s)。

1.7下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的檢測

行為學結束后，斷頭的同時收集血樣，室溫下凝固，3000 r/min離心15 min，取上清，采用放免法，按照試劑盒說明進行血清CRH、ACTH、CORT濃度的檢測。樣本存放于-20℃冰箱中待測。

1.8單胺類神經(jīng)遞質的檢測

大鼠斷頭后，于冰上分離大鼠腦組織，取出海馬，按100 mg組織加入500 μL裂解液，勻漿，14000 r/min離心15 min，取上清，過膜(0.45 μm)，取20 μL進樣，采用高效液相-電化學方法檢測單胺類神經(jīng)遞質的含量。流動相：500 mL中含醋酸鈉3.402 g，檸檬酸5.25 g，正辛基黃酸鈉0.05 g，三乙胺660 μL，Na2EDTA 0.1 g，色譜甲醇25 mL。流速：0.4 mL/min，電壓：0.3 v。主要檢測海馬去甲腎上腺素(NE)，多巴胺(DA)，5-羥色胺(5-HT)的濃度。樣本保存于-70 ℃待測。

1.9統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑對慢性不可預知溫和應激大鼠行為學的影響

2.1.1烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑對慢性不可預知溫和應激大鼠糖水偏嗜度的影響

實驗結果顯示：與正常對照組相比，模型組大鼠糖水的偏嗜度明顯降低(P<0.01)，而烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑各劑量組均能顯著增加模型大鼠糖水偏嗜度(P<0.01)(表1)。

2.1.2烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑對慢性不可預知溫和應激大鼠Morris水迷宮試驗的影響

2.1.2.1各組大鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較

實驗結果顯示：與正常對照組相比，從定位導航的第5次開始，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，與模型組相比，烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑 490 mg/kg、245 mg/kg劑量組可明顯縮短模型大鼠逃避潛伏期(P<0.05)(圖1)。定位航行實驗結果表明慢性應激可引起大鼠空間學習能力下降，導致空間學習障礙；烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑高、中劑量組可提高慢性應激大鼠的空間學習能力。

2.1.2.2各組大鼠空間搜索實驗結果比較

實驗結果顯示：與正常對照組相比，模型組大鼠在目標象限的時間及總路程明顯減少(P<0.05)，與模型組相比，烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑490 mg/kg劑量組可增加模型大鼠在目標象限的時間及總路程(P<0.05)(表2)。空間探索實驗結果表明，慢性應激可導致大鼠的空間記憶力減退，烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑高劑量可改善應激大鼠空間記憶能力。

2.2烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑對慢性不可預知溫和應激大鼠HPA軸的作用

實驗結果表明：與正常對照組相比，模型組大鼠血清中的ACTH、CORT、CRH含量明顯升高，而烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑490 mg/kg劑量組可顯著降低ACTH、CORT、CRH含量(P<0.05)(表3)。

組別Group劑量Dose(mg/kg)例數(shù)n糖水偏嗜度(%)Sucrosepercentage(%)對照組Control-1182.92±3.11**模型組Model-1265.60±8.56氟西汀Fluoxetine2.41280.75±5.81**烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑WulingpowderandHypericumperforatumL.4901175.92±4.97**2451172.97±4.13**1231272.89±3.12**

注：與模型組比較，**P<0.01。

Note: Compared with the model group,**P<0.01.

圖1　烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑對慢性應激模型大鼠定位導航持續(xù)時間的影響Fig.1　The effect of Wuling powder and Hypericum perforatum L. on place navigation test in CUS rats

組別Group劑量Dose(mg/kg)例數(shù)n目標象限總路程Routeoftargetquadrant(cm)目標象限總時間Timeoftargetquadrant(s)對照Control-111274.95±395.07*22.34±3.88*模型Model-121010.77±379.2018.21±5.31氟西汀Fluoxetine2.4121279.21±189.61*23.05±3.20*烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑WulingpowderandHypericumperforatumL.490111335.71±331.39*24.49±7.96*24591029.69±207.7019.18±2.38123111101.11±306.4421.69±4.59

注：與模型組比較，*P<0.05。

Note: Compared with the model group,*P<0.05.

組別Group劑量Dose(mg/kg)例數(shù)n促腎上腺皮質激素ACTH(pg/mL)皮質酮CORT(ng/mL)促腎上腺皮質激素釋放激素CRH(pg/mL)對照組Contol-1028.58±7.39*340.94±39.00*5.35±1.26*模型組Model-1033.97±6.65393.38±59.467.13±1.96氟西汀Fluoxetine2.41028.76±5.74*344.36±48.36*5.87±0.99烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑WulingpowderandHypericumperforatumL.4901026.83±4.86*299.77±44.33*5.51±1.62*2451027.19±3.96*382.25±55.516.32±2.241231028.83±5.40365.15±55.886.69±1.17

注：與模型組比較，*P<0.05。

Note: Compared with the model group,*P<0.05.

2.3烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑對慢性不可預知溫和應激大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質的作用

實驗結果表明：與正常對照組相比，模型組大鼠海馬組織單胺神經(jīng)遞質5-HT，NE和DA明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑490 mg/kg劑量組可明顯升高海馬組織5-HT，NE和DA的含量(P<0.05)(表4)。

Tab.4Effects of Wuling powder andHypericumperforatum

組別Group劑量Dose(mg/kg)例數(shù)n5-羥色胺5-HT(ng/mL)去甲腎上腺素NE(ng/mL)多巴胺DA(ng/mL)對照組Control-10585.05±227.59*150.08±28.40*89.42±22.44*模型組Model-10418.22±101.05129.60±29.3175.91±13.05氟西汀Fluoxetine2.410624.24±109.05*175.50±36.06*101.77±28.37*烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑WulingpowderandHypericumperforatumL.49010639.78±147.43*173.65±32.04*84.37±17.69*24510378.73±100.03140.43±38.7865.48±15.3612310354.57±62.15119.61±41.4375.97±29.27

注：與模型組比較，*P<0.05。

Note: Compared with the model group,*P<0.05.

3　討論

目前抑郁癥的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，成為研究熱點。研究過程中，合理的抑郁動物模型是關鍵，主要包括環(huán)境應激模型、社會刺激模型、手術制備模型、轉基因動物模型以及產(chǎn)后抑郁模型。其中，慢性不可預知應激致抑郁模型，因與實際生活中長期遭受低水平應激導致的抑郁癥行為特征相似，如自主活動減少、興趣缺失、探索能力以及學習能力低下等[2]，并且可伴與臨床抑郁癥患者相似的生理生化和激素水平等的改變，是公認的抑郁癥模型。此外，該模型還具有成模率高、可持續(xù)性長等特點，廣泛應用于藥物篩選、機制的探究、心理行為變化等[3-5]方面研究。

本實驗選用慢性不可預知應激加孤養(yǎng)模型，連續(xù)給藥28 d，行為學結果顯示，模型組大鼠糖水偏嗜度明顯降低，與抑郁患者興趣缺失的癥狀相似，給予烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑治療后可顯著增加慢性應激大鼠糖水偏嗜度。Morris水迷宮是常用于評價學習記憶能力的方法，用于檢測空間學習能力和空間記憶能力，動物成功找到逃避潛伏期時間越長，空間學習能力越差，烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑可縮短模型動物逃避潛伏期，改善模型動物學習記憶能力。上述行為學研究結果顯示，烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑對慢性應激抑郁模型大鼠具有一定的治療作用。

應激反應會引起單胺遞質含量不足、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子減少以及HPA軸功能失調(diào)[6-8]，其中最主要的特征是HPA軸活化，有研究表明抑郁癥患者血清COR、ACTH的含量顯著升高，且出現(xiàn)COR、ACTH分泌晝夜節(jié)律紊亂[9]。國外研究顯示，海馬是HPA軸負反饋的高級中樞，也是應激損傷的敏感部位，持續(xù)的應激刺激使會導致抑郁患者或動物腦內(nèi)獎賞環(huán)路如前額皮層、杏仁核以及海馬等腦區(qū)神經(jīng)元萎縮，海馬作為調(diào)控學習記憶功能的重要腦區(qū)，對于獲取信息、鞏固、儲存記憶起著關鍵作用，慢性應激可降低模型大鼠海馬組織中5-HT、NE、DA蛋白含量[10-13]。而中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT、NE等含量降低，則發(fā)生抑郁，本實驗結果顯示，模型組大鼠海馬組織中5-HT、DA、NE的含量明顯降低，血漿CORT、ACTH、CRH含量升高，烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑可顯著降低血漿CORT、ACTH、CRH的含量，升高海馬組織單胺類神經(jīng)遞質。綜上所述，烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑具有抗抑郁作用，其機制與提高海馬單胺類神經(jīng)遞質含量，調(diào)節(jié)HPA軸功能有關。

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Effects of mixture of Wuling powder andHypericumperforatumL. on depressed model rats induced by chronic unpredictable stress

LIU Xiao-meng1,2, ZHANG Rong1, DONG Shi-fen1, CHENG Gong-ni, CHANG Hong-sheng1, SUN Jian-ning1

(1. School of Chinese Material Medical, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China;2. National Center for Safety Evaluation of Drugs, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100176, China)

ObjectiveTo observe the effects of Wuling powder andHypericumperforatumL. on changes of behavior, the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis function, and monoamine neurotransmitters concentration of hippocampus on chronic unpredictable stress model in rats. MethodsDepression model was induced by chronic unpredictable stress combining with solitary method. The stimulus lasted for 4 weeks. During the stress, the rats were intragastric given with the decoction of Wuling powder andHypericumperforatumL. (490 mg/kg, 245 mg/kg, 123 mg/kg) and Fluoxetine hydrochloride (2.4 mg/kg) for 4 weeks. At the end of the experiment, sucrose consumption and Morris Water Maze experiment monitor the behavior of rats, such as sucrose consumption, escape latency. Moreover, the levels of the monoamine neurotransmitters in the hippocampus were analyzed by high performance liquid chromatography-electrochemistry and the content of CORT, ACTH, CRH in plasma were detected by Radioimmunoassay. ResultsIn Morris Water Maze test, the escape latency of rats which were consecutively administrated with Wuling powder andHypericumperforatumL. for 4 weeks decreased obviously; the total time and distance in target quadrant remarkably increased (P< 0.05). In sucrose consumption experiment, the percentage in sugar water consumption with treatment of Wuling powder andHypericumperforatumL. increased significantly (P< 0.01). Meanwhile, the content of norepinephrine (NE), dopamine (DA) , and 5-hydroxytryptamine (5-HT) in the hippocampus were significantly increased in rats of Wuling powder andHypericumperforatumL. and the concentrations of CORT, ACTH, CRH in plasma of Wuling powder andHypericumperforatumL. group rats were decreased obviously (P<0.05). ConclusionsThe disturbances of cognition, learning and memory function of rats induced by chronic unpredictable stress combining with solitary could alleviated by Wuling powder andHypericumperforatumL., and the pharmacological effects may related to modulation of monoaminergic neurotransmitters in the hippocampus and the content of CORT, ACTH, CRH in plasma.

Wuling powder andHypericumperforatumL.; Chronic unpredictable stress; Antidepressant; Hypothalamus-pituitary-adrenal axis; Neurotransmitter

劉曉萌(1981-)，女，助理研究員，學士，主要從事藥物安全性評價工作，研究方向：中藥藥理。E-mail：liuxm@nifdc.org.cn；張榮(1990-)，女，碩士生，研究方向：中藥神經(jīng)精神藥理研究。

孫建寧(1954-)，女，教授，博士生導師，研究方向：中藥防治重大疾病創(chuàng)新藥物研究，E-mail：jn_sun@sina.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0081-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.013

2016-02-01