模擬微重力對獼猴肺組織趨化因子CCL20及其受體CCR6表達的影響

許崇玉，王 萍，陳 楊，朱敏立，司少艷，蔡藝靈，馬華松，陳志明

模擬微重力對獼猴肺組織趨化因子CCL20及其受體CCR6表達的影響

許崇玉1，王 萍1，陳 楊2，朱敏立2，司少艷3，蔡藝靈4，馬華松5，陳志明5

目的 探討模擬微重力對獼猴肺組織CC亞族趨化因子配體20（CCL20）及趨化因子受體6（CCR6）mRNA和蛋白表達的影響。方法 15只獼猴分為3組，每組5只：對照組、模擬組、恢復組。HE觀察獼猴肺組織結構，實時熒光定量 PCR、免疫組化法檢測肺組織中CCL20及CCR6 mRNA和蛋白表達。結果 模擬組和恢復組獼猴肺組織可見肺泡間隔增厚，肺間質內及支氣管旁可見淋巴細胞浸潤，恢復組較模擬組減輕。模擬組、恢復組CCL20 mRNA的表達水平較對照組增高，但差異無統計學意義。模擬組CCR6 mRNA的表達水平較對照組、恢復組顯著增高（P＜0.01）。模擬組CCL20及CCR6蛋白表達較對照組、恢復組顯著升高（P＜0.05）。結論 中、長期模擬微重力可引起肺組織結構破壞、淋巴細胞浸潤，并可引起獼猴肺組織中CCL20及CCR6表達增強。

模擬微重力；獼猴；肺組織；CCL20；CCR6

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：01 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.012.htm l

隨著我國載人航天事業的深入發展，空間環境中機體防護顯得尤為重要。由于肺自身特點，導致其對重力變化極其敏感［1］。研究［2］表明，失重可導致肺組織結構病理損傷并伴有細胞因子的變化。CCL20是近期發現的趨化因子，與其唯一同源性受體CCR6［3］結合，可誘導多種淋巴細胞遷移，在炎癥損傷和免疫應答中發揮重要作用［4］。研究［5-6］表明CCL20/CCR6可參與多種肺組織疾病，促進氣道炎癥的發生和發展。湯楚華等［7］發現，模擬失重可引起獼猴牙齦組織CCL20和CCR6表達增加，在牙齦組織應激過程中發揮作用。然而，目前國內外未見失重狀態下CCL20/CCR6在肺組織中相關作用的報道。該研究以獼猴為對象，采用模擬微重力模型［8］，觀察失重對肺組織結構及CCL20、CCR6 mRNA和蛋白表達的影響，為進一步研究空間環境下肺組織結構及功能變化提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑和動物模型

1.1.1 主要試劑 一抗為山羊抗人CCL20多克隆抗體、鼠抗人CCR6單克隆抗體（美國R&G公司）；二抗為抗兔/抗鼠通用型免疫組化試劑盒（丹麥Da-Ko公司）；山羊超敏二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國 Thermo公司）；SYBR?Green Real-time PCR Master Mix試劑盒（日本TOYOBO公司）。

1.1.2 模型制備 健康雄性獼猴15只，年齡4～8歲，體重約8 kg，由北京協爾鑫生物資源研究所提供。獼猴按體重配對，隨機均等分為3組，即對照組：在籠內自由活動6周；模擬組：在特制的頭低位模擬失重效應裝具上生活6周；恢復組：在特制的頭低位模擬失重效應裝具上生活6周，隨后在籠內自由活動4周。以獼猴臥床頭低位-10°模擬微重力效應。所有獼猴用標準動物飼料喂養，室溫（22± 2）℃，人工控制室內照明，保持12 h光照（8：00～20：00）和黑暗（20：00～次日8：00）交替循環。實驗動物的使用及操作過程全部符合實驗動物國家標準，且通過了中國人民解放軍第306醫院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 取材與切片制作 飼養周期結束后，獼猴在麻醉狀態下放血處死。取獼猴肺組織標本，分別置于10%福爾馬林溶液、RNAlater溶液及凍存于液氮中備用。按常規石蠟切片制作方法制作4μm連續切片，進行后續的HE及免疫組化染色。

1.2.2 HE染色觀察肺組織病理學變化 將上述石蠟切片按常規HE染色法染色，即二甲苯脫蠟后經無水乙醇、90%酒精、80%酒精、75%酒精下行至蒸餾水；蘇木精染色；1%鹽酸酒精分化；伊紅染色；從低至高梯度酒精脫水，二甲苯透明，光學樹膠封片。Leica顯微鏡觀察，拍照。

1.2.3 實時熒光定量PCR（Q-PCR）法檢測肺組織CCL20、CCR6 mRNA的表達

1.2.3.1 引物的設計與合成 根據GenBank中獼猴 CCL20及CCR6 mRNA序列，以Primer Premier 3.0軟件設計特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，以 GAPDH為內參照，引物序列見表1。

表1 Q-PCR使用的特異性引物序列

1.2.3.2 總RNA的提取 取凍存于-80℃冰箱RNAlater溶液中的肺組織，應用TRIzol試劑盒，按照說明書提取總RNA。以ND-1000核酸定量檢測儀（美國Thermo公司）測定總RNA的濃度及吸光度（absorbance，A）值即A260、A280，以 1.8≤A260/A280≤2.0為合格。總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見明顯的18 S、28 S兩條區帶，所有樣本總 RNA均為1.8≤A260/A280≤2.0，證明所提取的總 RNA質量較好。

1.2.3.3 逆轉錄反應 吸取2μg總RNA，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作步驟逆轉錄合成 cDNA。逆轉錄條件：65℃、5 min；42℃、60 min；70℃、5 min；-20℃保存。

1.2.3.4 Q-PCR法檢測 反應體系：SYBR?Green Real-time PCR Master Mix 10μl，上游引物（10 μmol/L）0.4μl，下游引物（10μmol/L）0.4μl，cDNA 1μl，RNase Free Water 8.2μl；以GAPDH為內參。反應條件為：95℃預變性30 s；95℃、5 s；60℃、34 s；共40個循環；95℃、15 s；60℃、1 min；95℃、15 s。實驗數據應用2-ΔΔCt進行處理，計算各樣本平均Ct值及ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH），計算2-ΔΔCt，其數值表示CCL20、CCR6 mRNA相對于GAPDH的表達倍數。

1.2.4 免疫組織化學染色 采用SP免疫組化法，切片按常規經二甲苯脫蠟后經無水乙醇、90%酒精、80%酒精、75%酒精下行至蒸餾水；0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液熱抗原修復；30%H2O2室溫封閉內源性過氧化物酶30 min；蒸餾水洗3次；山羊血清封閉30 min；滴加CCL20抗體（1∶1 000）或CCR6抗體（1∶2 000），4℃，過夜；蒸餾水、1×PBS分別洗3次；滴加抗山羊或抗鼠/抗兔二抗，室溫孵育1 h；蒸餾水、1×PBS分別洗3次；DAB顯色；蘇木精染色；1%鹽酸酒精分化；從低至高梯度酒精脫水，二甲苯透明，光學樹膠封片。Leica顯微鏡觀察獼猴肺組織中CCL20/CCR6的表達情況。以肺組織和（或）結締組織胞膜或胞質中有黃色或棕黃色顆粒為CCL20/CCR6陽性反應。

采用雙盲法觀察切片，每張切片隨機選取5個高倍視野（×200），主動排除“邊緣效應”的干擾，分別對陽性細胞的百分比和染色強度給予評分，總分為兩者之積，半定量判斷結果。陽性細胞的百分比：陽性細胞數＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51% ～75%為 3分，76% ～100%為 4分。染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行分析，計量資料數據以±s表示。多樣本均數的比較采用單因素方差分析；兩組間差異性比較，方差齊性者采用LSD法檢驗，方差不齊則采用Dunnett t檢驗；變量間的相關分析采用Spearman秩相關分析。

2 結果

2.1 肺組織病理結構改變 對照組獼猴肺組織肺泡壁形態、大小均勻，肺泡腔內未見淤血、水腫；模擬組肺組織部分肺泡間隔增寬，肺間質內及支氣管旁可見淋巴細胞團塊狀浸潤；恢復組上述病理改變較模擬組稍減輕。見圖1。

圖1 獼猴肺組織HE染色A：對照組；B：模擬組；C：恢復組；1：×100；2：×400

2.2 肺組織CCL20、CCR6 mRNA表達情況 QPCR結果顯示，對照組（8.48±5.36）、模擬組（7.27 ±2.43）、恢復組（6.61±1.51）獼猴肺組織CCL20 mRNA表達呈增高趨勢，模擬組是對照組的2.31倍，恢復組是對照組的3.65倍，但各組間差異無統計學意義（F=0.36）。各組獼猴肺組織CCR6 mRNA表達分別為對照組（8.22±1.93）、模擬組（5.10 ±1.46）、恢復組（8.56±1.32），模擬組是對照組的9.63倍，恢復組是對照組的0.87倍，模擬組表達CCR6較對照組、恢復組增高，差異有統計學意義（F =7.19，P＜0.01），但對照組和恢復組比較差異無統計學意義（F=7.19）。對CCL20和CCR6 mRNA在各組獼猴肺組織中表達變化進行相關性分析顯示，兩者之間無顯著相關性（rs=0.48）。見圖2。

2.3 肺組織CCL20免疫組化結果 CCL20免疫組化染色結果表明，各組獼猴肺組織均可見CCL20弱陽性表達，呈黃色或棕黃色，陽性細胞既可分布于支氣管上皮細胞、血管內皮細胞、肺泡上皮細胞，胞質、胞核均有表達，胞質多見，亦可見于肺組織中浸潤的淋巴細胞中（圖3）。各組CCL20免疫組化評分結果分別為：對照組（1.20±1.10）分、模擬組（3.20± 0.84）分、恢復組（1.60±1.14）分。與對照組、恢復組比較，模擬組CCL20免疫組化評分顯著增高，差異有統計學意義（F=5.25，P＜0.05），對照組、恢復組間比較差異無統計學意義（F=5.25）。

圖2 CCL20 m RNA和CCR6 mRNA在獼猴肺組織中表達的相關性分析

圖3 各組獼猴肺組織CCL20免疫組化染色結果 SP×400 A：對照組；B：模擬組；C：恢復組

2.4 肺組織CCR6免疫組化結果 CCR6主要表達于支氣管上皮細胞、血管內皮細胞、肺泡上皮細胞及淋巴細胞浸潤區域，胞質、胞核均可著色，以胞質為主，呈黃色或棕黃色（圖4）。各組獼猴肺組織CCR6免疫組化評分結果分別為：對照組（1.20± 0.45）分、模擬組（5.20±1.79）分、恢復組（2.00± 1.87）分。與對照組、恢復組比較，模擬組CCR6免疫組化評分分值顯著增高，差異有統計學意義（F= 9.74，P＜0.01），對照組、恢復組比較差異無統計學意義（F=9.74）。

3 討論

趨化因子是一組有相似結構特點、低分子量（8～10 ku）細胞因子家族，由多種組織細胞及炎性細胞產生，有多種生物學活性，能夠趨化多種免疫細胞的遷移，在多種疾病的炎癥損傷和免疫應答中發揮重要作用［9-10］。根據其N末端保守的半胱氨酸殘基的排列方式，趨化因子可分為4類：CC亞族、CXC亞族、C亞族和CX3C亞族［11］。趨化因子受體屬于G蛋白偶聯受體家族，主要表達于內皮細胞和免疫細胞。根據結合的配體不同，亦可分為4類：CCR類、CXCR類、CR類和CX3CR類。趨化因子與其相應受體結合，對多種免疫細胞發揮趨化作用，在特異性和非特異性免疫應答中發揮重要作用，同時在生理及病理條件下也參與機體多種生物學功能［7］。CCL20是近年來發現的CC亞族新成員，CCR6是CCR類趨化因子受體，是一個高度保守的G蛋白偶聯受體，主要表達于未成熟的樹突狀細胞，也可表達于T細胞、NKT細胞、B細胞及肺、腸和肝等組織［3，12］，CCL20和CCR6間相互作用可介導上述免疫細胞向黏膜組織的轉移，參與局部炎癥反應及免疫應答。

圖4 各組獼猴肺組織　CCR6免疫組化染色結果 SP×400A：對照組；B：模擬組；C：恢復組

目前，國內外尚未見失重或模擬失重狀態下肺組織CCL20和CCR6表達情況及CCL20/CCR6是否在失重狀態下肺組織淋巴細胞浸潤中發揮作用的相關報道。因此本研究首次采用了在生物進化上以及組織器官結構、生理習性和代謝機能上同人類相近的獼猴，利用地面模擬微重力模型觀察中、長期微重力狀態下獼猴肺組織結構的病理改變及從mRNA和蛋白水平上對肺組織中CCL20、CCR6的表達進行探討。本研究顯示模擬微重力狀態下獼猴肺組織間隔增厚、部分肺泡融合，淋巴細胞浸潤程度較高，呈團塊狀浸潤，證實了失重或模擬微重力可引起肺組織結構破壞、淋巴細胞浸潤增多，這與王小輝等［13］的研究結果一致。

本實驗Q-PCR結果顯示對照組、模擬組、恢復組獼猴肺組織 CCL20 mRNA的表達水平呈增加趨勢，但差異無統計學意義，可能與CCL20在肺組織本身表達量較低有關；與對照組、恢復組比較，模擬組肺組織CCR6 mRNA表達水平顯著增加，但對照組與恢復組之間差異無統計學意義。免疫組化結果表明，CCL20和CCR6在模擬組肺組織中表達較對照組及恢復組顯著增高，表明失重或模擬微重力效應可引起獼猴肺組織CCL20、CCR6蛋白表達增加。Q-PCR和免疫組化結果提示：模擬微重力狀態下獼猴肺組織中CCR6 mRNA和蛋白表達水平增高，而CCL20 mRNA表達水平未見明顯升高，但蛋白表達增強。CCR6作為CCL20的唯一同源性受體，兩者mRNA的表達無顯著相關性。模擬微重力引起趨化因子CCL20 mRNA和蛋白水平表達的不一致性，可能與基因的轉錄后調控有關，具體機制有待于進一步研究。Conejo-Garcia et al［14］發現β-防御素是人體內能夠作用于CCR6的生物活性物質，能夠與CCL20競爭CCR6結合位點，而發揮相似的作用。Zissel et al［15］的初步研究結果顯示CCL18也可作用于CCR6而發揮趨化作用。結合本研究結果，考慮CCL20/CCR6可能參與模擬微重力下肺組織中淋巴細胞浸潤過程，但通過何種途徑介導該過程，還需進一步的研究。

綜上所述，中、長期模擬微重力可引起獼猴肺組織結構破壞、淋巴細胞浸潤，同時可引起CCL20及CCR6表達增強，這可能是介導模擬微重力狀態下肺組織中淋巴細胞浸潤增多的原因之一。

［1］ Prisk G K.Mircogravity and the respiratory system［J］.Eur Respir J，2014，43（5）：1459-71.

［2］ 李天志，劉長庭，李向紅，等.模擬失重對大鼠血清及肺組織細胞因子的影響研究［J］.重慶醫學，2007，36（12）：1152-4.

［3］ Ito T，Carson W F 4th，Cavassani K A，et al.CCR6 as amediator of immunity in the lung and gut［J］.Exp Cell Res，2011，317 （5）：613-9.

［4］ Lee A Y，Phan T K，Hulett M D，etal.The relationship between CCR6 and its bidding partners：does the CCR6-CCL20 axis have to be extended？［J］.Cytokine，2015，72（1）：97-101.

［5］ Demedts IK，Bracke K R，Van Pottelberge G，etal.Accumulation of dendritic cells and increased CCL20 levels in the airways of patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］.Am JRespir Crit Care Med，2007，175（10）：998-1005.

［6］ PichavantM，Charbonnier A S，Taront S，etal.Asthmatic bronchialepithelium activated by the proteolytic allergen Der p 1 increases selective dendritic cell recruitment［J］.JAllergy Clin Immunol，2005，115（4）：771-8.

［7］ 湯楚華，牛忠英，鄭燕華，等.模擬失重30 d后再超重對猴牙齦組織趨化因子CCL20及其受體CCR6表達的影響［J］.上海口腔醫學，2014，23（3）：273-9.

［8］ Regnard J，Heer M，Drummer C，et al.Validity of microgravity simulationmodels on earth［J］.Am JKidney Dis，2001，38（3）：668-74.

［9］ Balkwill F R.The chemokines system and cancer［J］.JPathol，2012，226（2）：148-57.

［10］Blanchet X，Langer M，Weber C，et al.Touch of chemokines［J］. Front Immunol，2012，3：175.

［11］Zlotink A，Yoshie O.Chemokines：a new classification system and their role in immunity［J］.Immunity，2000，12（2）：121-7.

［12］Elgueta R，Marks E，Nowak E，et al.CCR6-dependent positioning ofmemory B cells is essential for their ability tomounta recall response to antigen［J］.J Immunol，2015，194（2）：505-13.

［13］王小輝，王 萍，朱敏立，等.N-乙酰半胱氨酸對模擬失重肺炎大鼠的保護性研究［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（11）：1544-8.

［14］Conejo-Garcia JR，Benencia F，CourregesM C，et al.Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A［J］.Nat Med，2004，10（9）：950-8.

［15］Zissel G，Hohne K，Kilic A，et al.CCR6 is a receptor for CCL18 expressed on human lung fibroblasts from IPF lungs［J］.Eur Respir J，2011，38（Suppl 55）.

Effect of simulated weightlessness on the expression of chemokine CCL20 and it′s receptor CCR6 in lung of rhesusmonkey

Xu Chongyu1，Wang Ping1，Chen Yang2，et al
（1The 306th Hosptial of PLA Cinical College of Anhui Medical University，Beijing 100101；
2Deptof Respiratory and Critical Care Medicine，The306th Hosptial of PLA，Beijing 100101）

Objective To investigate the effect of simulated weightlessness on themRNA and protein expression of chemokine CCL20 and it′s receptor CCR6 in lung of rhesusmacaque.Methods Fifteen healthy youngmale rhesus monkeyswere randomly divided into3 groups：control group，simulated group and recovery group.HE stainingwas used to observe the histopathological structure changes of pul-monary tissues.And themRNA and protein expression of CCR6 and CCL20 in lung tissue were detected by immunohistochemistry and quantitative real-time PCR（QPCR）.Resu lts Compared with the control group，histopathological examination revealed alveolar septal thickening，and alveolar and interstitial lymphocytic infiltration in simulated group and recovery group，and the pathological changes in recovery group were lighter than those in simulated group.The expressions of CCL20mRNA in simulated group and the recovery group were higher than that in the control group，but there was no significant difference；the expression of CCR6 mRNA in simulated group was significantly higher than that in the control group and the recovery group（P＜0.01），but there was no significant difference between the control group and the recovery group.Immunohistochemistry results showed that CCL20 and CCR6 were expressed in the lung tissues of each group，but the expression of CCL20 was weak.The positive cells were found mainly in the cytopl-asm of bronchial and alveolar epithelial cellsand vascular endothelial cells.The protein expression of CCL20 and CCR6 in simulated group were significantly higher than that in the control group and the recovery group（P＜0.05）.Conclusion Medium or long term simulated weightlessness can induce the destruction of lung tissue structure and infiltration of lymphocytes，and it can also significantly enhance the mRNA and protein expression of CCL20 and its receptor CCR6 in lung tissues.

simulated weightlessness；rhesusmacaque；lung；CCL20；CCR6

R 563.9；V 7

A

1000-1492（2016）04-0484-05

2016-01-18接收

總裝備部試驗技術研究重點項目（編號：SMFA13K02）

1安徽醫科大學解放軍306臨床學院，北京 100101
解放軍第306醫院2呼吸與危重癥學科、3特種醫學實驗研究中心、4神經內科、5骨科，北京 100101

許崇玉，男，碩士研究生；
王 萍，女，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：pingwang306hpbj@163.com