化學合成m icroRNA-29a inhibitors和m im ics 對SD大鼠心肌成纖維細胞活化增殖的影響

陳澤文，陶 輝，周 曉，施 鵬，張家貴，宣海洋，占紅英，石開虎

化學合成m icroRNA-29a inhibitors和m im ics 對SD大鼠心肌成纖維細胞活化增殖的影響

陳澤文，陶 輝，周 曉，施 鵬，張家貴，宣海洋，占紅英，石開虎

目的 探討微小RNA-29a（miR-29a）inhibitors和mimics對大鼠心肌成纖維細胞活化增殖的影響。方法 取SD大鼠心肌組織，以組織塊酶消化法分離細胞，通過差速貼壁離心法收集、培養SD大鼠心肌成纖維細胞。應用LipofectamineTM2000 Reagent分別向大鼠心肌成纖維細胞瞬時轉染miR-29a inhibitors和miR-29amimics24 h和48 h后，實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測miR-29a、Ⅰ型膠原前膠原A1（Col1A1）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的RNA水平的表達，MTT法檢測細胞增殖活性。結果 與正常對照組和陰性對照組比較，在瞬時轉染miR-29a inhibitors的心肌成纖維細胞中，miR-29a的表達水平下調；而在轉染miR-29a m imics的心肌成纖維細胞中，miR-29a的表達水平上調。Col1A1在miR-29a inhibitors組中表達水平升高，而在miR-29am imics組中則表達水平降低。α-SMA在miR-29a inhibitors組中表達水平升高，在miR-29a mimics組中則表達水平降低。瞬時轉染miR-29am imics 24、48 h后，與空白對照組和其陰性對照組相比較，心肌成纖維細胞活力明顯下降；而瞬時轉染miR-29a inhibitors 24、48 h后，心肌成纖維細胞活力則明顯增強。結論 miR-29am imics可明顯抑制心肌成纖維細胞增殖活性，而miR-29a inhibitors則顯著提高心肌成纖維細胞的增殖活性，提示心肌纖維化的形成可能與miR-29a表達下調有關，其潛在的分子作用機制有待進一步研究。

microRNA-29a；心肌成纖維細胞；Col1A1；α-SMA；quantitative real-time PCR

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：01 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.016.htm l

心肌纖維化是心房顫動（atrial fibrillation，AF）的病理生理學基礎，可導致心律失常的發生和持續［1］。心肌纖維化表現為細胞外基質（extracellular cellmatrix，ECM）和膠原蛋白的過度沉積，最終導致心肌功能的損害。在此過程中，心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）發揮著重要的作用，其活化增殖則是心肌纖維化的關鍵環節［2-3］。心肌纖維化形成的詳細機制目前尚未完全明確，然而現有研究［4］表明已有不少miR涉及心臟疾病的發生發展，其被稱為心臟微小RNA。miR是一類短鏈、高度保守的非編碼RNA，在干擾轉錄和基因表達方面起著重要的調控作用［3］。miR-29a作為miR-29家族中的一員，已被證實在心肌纖維化中表達水平有顯著變化［5］。該研究通過觀察miR-29a在大鼠CFs活化中的表達變化，初步探討miR-29a在心肌纖維化中的作用，為心肌纖維化的預防和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD乳鼠60只，出生1 ～3 d，平均體重8 g，由安徽醫科大學動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑 HyClone?DMEM/High Glucose培養基、Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和 Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2×）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清購自英國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國 Wisent公司；miR-29a inhibitors和miR-29a mimics、EzOmicsmiRNA qPCR Detection Primer試劑盒和EzOmics One-Step qPCR試劑盒購自美國Biomic公司；LipofectamineTM2000 Reagent、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；Opti-MEM?I（1×）購自美國Life Technologies公司；MTT相關試劑購自美國Sigma公司；轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）購自美國Peprotech公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 主要儀器 NAPCO-6100型細胞培養箱（美國SHELLAB公司）；SW-CJ-IF型超凈工作臺（蘇州泰安空氣技術有限公司）；eppendorf Centrifuge 5417R高速冷凍離心機（德國eppendorf公司）；StepOne?Real-Time PCR System（美國ABI公司）；NanoPhotometer P-Class分光光度儀（德國Implen GmbH公司）；酶標儀MK3（荷蘭雷勃公司）。

1.4 方法

1.4.1 CFs的提取與細胞培養 取出生3～5 d內的SD大鼠于75%乙醇溶液缸中浸泡20 s后，轉移至超凈臺。用無菌剪刀取出心臟，置于高壓蒸汽滅菌過的培養皿中。將大鼠心臟全部取出后，盡量完全剔除心臟上的心房、結締組織、脂肪和血管，預冷PBS液沖洗3次以去除血污。將心臟轉移至離心管后剪成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加入酶消化液3 ml、37℃水浴并振蕩15 min，自然沉降1 min后吸取上清液入新離心管，加入3 ml 37℃的DMEM培養基終止消化，混勻后以900 r/min離心9 min，反復操作3次，棄上清液，細胞沉淀加入4 ml、37℃的含10%胎牛血清的DMEM培養基吹散細胞后，接種于培養瓶中，2 h后使用差速離心貼壁法分離以保留CFs。在5%CO2、37℃培養箱中放置過夜。培養CFs至80%～90%匯合狀態時，采用胰蛋白酶予以消化傳代培養，取2～4代細胞用于實驗，經倒置顯微鏡、免疫組化方法鑒定為CFs。

1.4.2 瞬時轉染miR-29a inhibitors和mimics 取對數生長期CFs進行轉染實驗。轉染前1 d，將CFs細胞計數后，接種于6孔板，用Opti-MEM稀釋待轉染。成熟miR-29a inhibitors/mimics由美國Biomic生物技術公司設計并合成。引物序列如下：miR-29a mimics上游引物：5′-UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3′，下游引物：5′-UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3′；miR-29a inhibitors引物序列：5′-UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3′。將 miR-29a inhibitors和mimics及其陰性對照分別與脂質體LipofectamineTM2000 Reagent輕吹混勻，室溫靜置20 min后，加入相應各孔細胞中，37℃、5%CO2保溫箱孵育24 h，更換含血清及雙抗的DMEM完全培養基并用濃度為10 ng/m l的TGF-β1刺激細胞生長，轉染48 h后提取轉染后細胞的總RNA。

1.4.3 總RNA提取和一步法qRT-PCR檢測miR-29a 檢測轉染后CFs中的miR-29a含量，用StepOne?Real-Time PCR系統進行qRT-PCR檢測。采用TRIzol并根據操作手冊一步法抽提細胞總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度，通過計算吸光度（absorbance，A）值，A260/A280的比值了解其純度并選取比值在1.8～2.0的RNA樣品進行試驗。采用EzOmics miRNA qPCR Detection Primer試劑盒與EzOmics One-Step qPCR試劑盒并參照操作手冊檢測miR-29a。反應條件如下：42℃、30 min，95℃、10 min，接著95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s共40循環的擴增階段條件；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s的溶解曲線階段條件。以U6作為內參，用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達水平。

1.4.4 qRT-PCR法檢測Col1A1和α-SMA mRNA表達 總RNA用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒并參照操作手冊逆轉錄合成cDNA，然后應用Maxima SYBR Green/ ROX qPCR Master Mix（2×）試劑盒并參照操作手冊進行qRT-PCR檢測。從GenBank中查找引物序列并設計合成相應引物。引物序列如下：鼠源Col1A1上游引物：5′-TAACTTCTGGACTATTTGCGGACTTT TTGG-3′，下游引物：5′-GTCCAGCCCTCATCCTGGCC-3′。鼠源α-SMA上游引物：5′-TGGCCACTGCTGCTTCCTCTTCTT-3′，下游引物：5′-GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCT-3′。鼠源β-actin上游引物：5′-ACGGTCAGGTCATCACTATC-3′，下游引物：5′-ACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3′。反應條件如下：50℃、2 min，95℃、10min，接著95℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s共50個循環的擴增階段條件；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s的溶解曲線階段條件。以β-actin作為內參，用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達水平。

1.4.5 MTT比色法檢測細胞增殖 檢測前設計分組：轉染miR-29a inhibitors組、轉染 miR-29a mimics組、陰性對照組和空白對照組。將處于對數生長期的各組CFs用胰蛋白酶消化后，完全培養基重懸形成細胞懸液。用血球計數板進行細胞計數。以每孔1×104的密度鋪于96孔板中，每組5個復孔，每孔200μl，連續監測2 d，鋪板過程中要確保每孔加入細胞數一致。置于37℃、5%CO2培養箱培養。從鋪板后第2天開始，每孔加入5 g/LMTT，繼續培養4 h，吸取培養上清液，每孔加入200μl DMSO，室溫下搖床振蕩10 min，使藍紫色結晶充分溶解，在酶標儀上測定各孔波長490 nm處A值。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，數據以±s表示。單變量兩組資料間的比較采用t檢驗，多組均數的比較采用方差分析。所有實驗數據分析重復至少3次。

2 結果

2.1 瞬時轉染m iR-29a m im ics、inhibitors對m iR-29a的表達影響 瞬時轉染CFsmiR-29amimics、in-hibitors及其陰性對照48 h后，One-step Real-time qPCR結果顯示，轉染miR-29a mimics后，與正常對照組和陰性對照組比較，實驗組miR-29a的表達顯著上調，差異具有統計學意義（t=13.56、13.86，P＜0.05），轉染miR-29a inhibitors后，與正常對照組和陰性對照組比較，實驗組miR-29a的表達明顯下降，差異有統計學意義（t=9.23、8.65，P＜0.05）。見圖1。

圖1 瞬時轉染48 h后各組CFs內　m iR-29a的表達變化1：陰性對照組；2：空白對照組；3：轉染　miR-29a mimics組；4：轉染　miR-29a inhibitors組；與空白對照組比較：*P＜0.05；與陰性對照組比較：##P＜0.01

2.2瞬時轉染m iR-29a m im ics、inhibitors對Col1A1和α-SMA的表達影響 瞬時轉染CFs miR-29a mimics、inhibitors及其陰性對照48 h后，Real-time qPCR結果顯示，轉染miR-29amimics后，與正常對照組和其陰性對照組比較，實驗組Col1A1和α-SMA的表達水平明顯下調，差異有統計學意義（Col1A1：t=7.31、7.22，P＜0.05；α-SMA：t=5.45、5.67，P＜0.05），轉染miR-29a inhibitors后，與正常對照組和其陰性對照組比較，實驗組Col1A1和α-SMA的表達水平顯著上升，差異有統計學意義（Col1A1：t=10.14、10.27，P＜0.05；α-SMA：t= 9.75、9.83，P＜0.05）。見圖2。

圖2 瞬時轉染48 h后各組CFs內　Col1A1和　α-SMA的表達變化1：陰性對照組；2：空白對照組；3：轉染　miR-29a mimics組；4：轉染miR-29a inhibitors組；與空白對照組比較：*P＜0.05；與陰性對照組比較：##P＜0.01

2.3 瞬時轉染m iR-29a m im ics、inhibitors對CFs活化增殖的影響 瞬時轉染CFs miR-29a mimics 24、48 h后，與空白對照組和其陰性對照組比較，實驗組CFs活力明顯下降，差異有統計學意義（F= 35.46、33.57，P＜0.05），而瞬時轉染CFsmiR-29a inhibitors24、48 h后，與空白對照組和其陰性對照組比較，實驗組CFs活力明顯增強，差異有統計學意義（F=21.23、25.18，P＜0.05）。見圖3。

圖3 瞬時轉染48 h后各組　CFs增殖活性變化1：陰性對照組；2：空白對照組；3：轉染　miR-29a mimics組；4：轉染　miR-29a inhibitors組；與空白對照組比較：*P＜0.05；與陰性對照組比較：##P＜0.01

3 討論

CFs是心臟中數量最多的細胞，在心肌纖維化中發揮重要的調控作用。在心肌纖維化的過程中，CFs受到TGF-β1、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等因子刺激，分化為以α-SMA為表面標志物肌成纖維母細胞，有較強的膠原分泌能力［6］。因此，心肌纖維化主要是通過CFs活化增殖成肌成纖維母細胞，促進Col1A1和α-SMA等的過度表達，使得ECM蛋白和膠原過度沉積，導致纖維化發生。

研究［3］表明，miR在纖維化器官尤其是心臟中起著重要的作用。如心梗大鼠敲除miR-21基因后，心肌纖維化水平降低，表明miR-21高表達可促進CFs的增殖［7］。miR-24可以維持TGF-β表達水平的穩定，以此以減少心肌纖維化的發生［8］。miR-29大多由成纖維細胞生成，miR-29家族是纖維化的關鍵調節因子，調節膠原和其他ECM基因在mRNA水平上的表達［9］。一方面，miR-29可以通過下調抗凋亡基因以促進心肌細胞凋亡；另一方面，miR-29可以抑制膠原生成，從而產生抗纖維化的作用。此外，miR-29a則可以通過上調RASSF1A表達水平，降低心肌纖維化水平［10］。miR-29a inhibitors和mimics分別是miR-29a的抑制劑和促進劑，可以分別抑制和促進miR-29a的表達，然而miR-29a在CFs活化增殖中具體的調控模式尚不十分清楚。

本研究用miR-29a inhibitors和mimics轉染體外培養的新生SD大鼠CFs，檢測轉染后CFs的增殖變化以及miR-29a、Col1A1和α-SMA的表達水平。結果表明miR-29amimics可明顯抑制CFs的增殖活性，降低Col1A1和α-SMA的表達水平；而miR-29a inhibitors則表現為促進CFs的增殖活性。

綜上所述，miR-29a mimics轉染CFs后，miR-29a表達上升，而CFs中miR-29a的高表達可以抑制其活化增殖，抑制心肌纖維化的發生發展，表明miR-29a是CFs活化增殖的潛在的靶向分子，這為預防和治療心肌纖維化提供新思路。

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Effect ofm icroRNA-29a inhibitors and m im ics on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats

Chen Zewen，Tao Hui，Zhou Xiao，et al
（Dept of Cardio-Thoracic Surgery，The Second Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Dept of Cardiovascular Disease Research Center，AnhuiMedical University，Hefei 230601）

Objective To explore the effection ofmiR-29a inhibitors and mimics on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats.Methods Cardiac fibroblasts were isolated from newly born male SD rats.miR-29a inhibitors or mimics was transfected respectively into cardiac fibroblasts through LipofectamineTM2000 Reagent. Twenty-four and Forty-eight hours after transfection，the expressions ofmiR-29a andmRNA of Col1A1 andα-SMA were analyzed by qRT-PCR.MTT assay was used to detect the proliferation activity of the transfected cardiac fibroblasts.Results Compared with normal group and negative group，expression ofmiR-29a was down-regulated in miR-29a inhibitors group while up-regulated inmiR-29amimics group.Col1A1mRNA expression was up-regulated in miR-29a inhibitors group while down-regulated inmiR-29amimics group.α-SMAmRNA expression was up-regulated in miR-29a inhibitors group while down-regulated inmiR-29amimics group.The cardiac fibroblasts proliferation activity decreased significantly after transfectedmiR-29amimicswhile increased in miR-29a inhibitors groups. Conclusion miR-29amimics can suppress the proliferation activity of cardiac fibroblasts significantly，implicating miR-29a as a potential target for cardiac fibroblasts activation and proliferation and pointing to this result can provide new way of thinking of interventions designed to prevent the cardiac fibrosis occurrence and development.

microRNA-29a；cardiac fibroblasts；Col1A1；α-SMA；qRT-PCR

R 542.2

A

1000-1492（2016）04-0493-04

2015-12-21接收

國家自然科學基金資助項目（編號：81570295）；安徽省自然基金（編號：1308085MH117、1408085MH175）

安徽醫科大學第二附屬醫院心胸外科、安徽醫科大學心血
管病研究中心，合肥 230601

陳澤文，男，碩士研究生；
石開虎，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：shikaihu@gmail.com