Tum statin轉基因巨核細胞在NOD/SCID鼠體內產生抗新生血管作用血小板

任薈蓉，羅以勤，李 娟，周 明，趙 亮，姚麗娟

Tum statin轉基因巨核細胞在NOD/SCID鼠體內產生抗新生血管作用血小板

任薈蓉1，羅以勤1，李 娟2，周 明2，趙 亮1，姚麗娟1

目的 了解tumstatin轉基因巨核細胞在非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷（NOD/SCID）鼠體內生成血小板情況及其抗新生血管作用。方法 制備的tumstatin轉基因巨核細胞注入NOD/SCID鼠體內，定期取血，通過流式細胞儀分析轉基因血小板產生情況；激光共聚焦法檢測血小板的tumstatin表達；內皮細胞管狀結構形成試驗檢測血小板的抗血管生成作用；血小板聚集試驗檢測轉基因血小板的聚集功能。結果 tumstatin轉基因巨核細胞輸注NOD/SCID鼠后的第3天，外周血可檢測到人血小板；血小板表達tumstatin；這種轉基因血小板可顯著抑制內皮細胞管狀結構形成并保持正常的聚集功能。結論 tumstatin轉基因巨核細胞可在NOD/SCID鼠體內產生有抑制血管形成且保持正常聚集功能的血小板，為進一步抗腫瘤研究奠定基礎。

tumstatin；巨核細胞；血小板；NOD/SCID鼠

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：01 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.024.htm l

腫瘤放化療引起患者血小板減少癥，在臨床上常預防性或治療性地輸注血小板以提高血小板水平，然而，近些年的研究［1-2］表明血小板有促進腫瘤新生血管形成作用，進而促進腫瘤的生長和轉移，影響患者預后。tumstatin是近些年發現的一種內源性血管生成抑制因子，其通過功能性受體特異性地誘導血管內皮細胞凋亡、抑制血管內皮細胞增殖，從而抑制腫瘤的生長［3］。攜帶tumstatin基因的慢病毒轉導CD34+細胞經體外擴增培養后生成有抗血管生成作用的巨核細胞/血小板［4］，該實驗采用這種轉基因巨核細胞輸注非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷（non-obese diabetic/server combined immune-deficiency，NOD/SCID）小鼠，觀察其在體內生成血小板的狀況及其相關功能，設想這種血小板有可能改變放化療過程中輸注常規血小板而引起的促進腫瘤血管生長的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 NOD/SCID鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；NK細胞抑制劑anti-asialo GM1購自日本和光純藥株式會社；小鼠抗人CD41-FITC購自美國eBioscience公司；兔抗人tumstatin蛋白抗體和羊抗人VWF蛋白抗體購自美國Gibco公司；FITC標記的抗兔二抗和PE標記的抗羊二抗購自英國Abcam公司；人靜脈內皮細胞購自上海吉凱公司；tumstatin轉基因巨核細胞由安徽醫科大學附屬省立醫院臨床檢驗中心制備。

1.2 方法

1.2.1 tumstatin轉基因巨核細胞輸注到NOD/ SCID鼠體內 6～7周齡NOD/SCID雌性小鼠，21.0～22.5 g，無菌環境下飼養，開始實驗前均至少讓小鼠在動物中心常規喂養適應1周。輸注前4～24 h，小鼠全身接受300～350 cGy亞致死劑量的輻射源照射。將小鼠隨機分為轉基因組、非轉基因組和對照組，分別為12、10、8只，4～24 h后，轉基因組進行tumstatin轉基因巨核細胞輸注（約1×105個），非轉基因組進行非轉基因巨核細胞輸注（約1 ×105個），對照組注射同體積生理鹽水。3組均用27G針頭，1 ml的注射器通過尾靜脈進行輸注，每組細胞輸注同時輸注20μl asialo GM1抗血清（自然殺傷細胞抑制劑）。

1.2.2 流式細胞儀分析轉基因血小板在小鼠體內的產生情況 轉基因組、非轉基因組和對照組小鼠分別在第3、5、7天各取2只，通過眼窩后取血，EDTA-K2抗凝后，500 r/min離心5 min獲得血小板，加入小鼠抗人CD41-FITC，室溫孵育30 min后，PBS洗滌3次，3 000 r/min離心5 min，重懸于適量生理鹽水，流式細胞儀定量檢測小鼠和人類的血小板，小鼠取血后處死。

1.2.3 激光共聚焦法檢測血小板的tumstatin表達

轉基因組、非轉基因組和對照組小鼠分別在第3天各取2只，通過眼窩后取血，EDTA-K2抗凝，500 r/min離心5 min獲得血小板，甩片機涂片，待涂片干燥后，4%多聚甲醛固定20 min，0.5%Triton-X-100通透15 min，接著用含1%BSA的pH 7.2 BSAPBS洗3遍后風干，5%小牛白蛋白4℃封閉過夜；第2天，用稀釋好的兔抗人tumstatin蛋白抗體和羊抗人VWF蛋白抗體覆蓋細胞，于濕盒中4℃孵育2 h；PBS洗滌后滴加FITC標記的抗兔二抗和 PE標記的抗羊二抗，室溫避光孵育2 h，PBS洗滌3遍；最后于細胞表面滴一滴抗熒光猝滅封片液，指甲油封片。熒光共聚焦顯微鏡用適合波段激發，觀察tumstatin和VWF蛋白的表達和定位，照相保存實驗結果。

1.2.4 內皮細胞管狀結構形成試驗檢測血小板的抗血管生成作用 轉基因組和非轉基因組小鼠分別在第3天各取2只，通過眼窩后取血，以正常人外周血作為對照組，EDTA-K2抗凝，離心獲得血小板約1 ×108/ml，液氮反復凍融3次裂解血小板以釋放蛋白；將50μl稀釋的ECMatrixTM加入96孔培養板，37℃孵育1 h，待ECMatrixTM凝固后，將150μl不含抗生素的人臍靜脈內皮細胞接種到上述包被ECMatrixTM的培養板中，每孔約含細胞數量5×103～1× 104個；分別加入血小板裂解液，試驗重復3次；細胞在37℃、5%CO2條件下繼續培養，在1、2、4、8、12 h時間點觀察不同處理組之間內皮細胞管狀排列情況、單位面積內管狀結構數量和完整程度的差異。

1.2.5 血小板聚集試驗檢測轉基因血小板的聚集功能 轉基因組小鼠在第3天取2只，通過眼窩后取血，EDTA-K2抗凝，離心獲得血小板，收集至15 m l離心管中；PBS洗滌2遍；以正常人血小板作為對照組；用血小板計數儀調整血小板濃度為1× 108/ml；將兩組血小板各取20μl滴入玻片上，顯微鏡下觀察血小板聚集前情況并拍照；分別加入凝血酶1 U/m l，37℃孵育10 min，顯微鏡下觀察血小板聚集情況并拍照。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析，數據以±s表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 tumstatin轉基因巨核細胞輸注到NOD/SCID鼠體內 瑞氏染色進行形態學分析顯示tumstatin轉基因細胞呈現出典型的巨核細胞形態，胞質內充滿大小不等的紫紅色顆粒或血小板，細胞周圍可見有血小板堆集；表明轉基因表達并不影響CD34+細胞誘導分化為巨核細胞和血小板，見圖1。

圖1　CD34+誘導分化的　tum statin轉基因巨核細胞及血小板 油鏡×1 000

2.2 流式細胞儀分析tumstatin轉基因血小板在小鼠體內的產生情況 流式細胞術檢測tumstatin轉基因巨核細胞輸注后第3、5、7天小鼠全血樣本，可在第3天檢測到大量血小板，且在第5天減少，第7天基本檢測不到，這與預計的基因修飾的巨核細胞產生的血小板會在小鼠體內活躍5～7 d是相符的。非轉基因組血小板的產生情況與轉基因組大致一致，對照組檢測不到CD41-FITC標記陽性的細胞，見圖2。

2.3 激光共聚焦法檢測血小板的tumstatin表達

在適當波長的激發光照射下，用熒光共聚焦顯微鏡可以觀察到，在小鼠外周血里，存在部分血小板（tumstatin轉基因血小板）既表達自身VWF蛋白又顯示出tumstatin蛋白的表達，而非轉基因組僅表達自身VWF蛋白。對照組則檢測不到人血小板。研究結果表明通過慢病毒介導，tumstatin基因修飾的巨核細胞成功在小鼠體內存活并產生表達tumstatin蛋白的血小板，見圖3。

2.4 內皮細胞管狀結構形成試驗檢測血小板的抗血管生成作用 當人臍靜脈內皮細胞在基質上培養時，其迅速排列形成中空管狀結構。研究結果顯示非轉基因的血小板血管分支數約為（101.3±10.9）個；tumstatin轉基因血小板血管分支數約為（42.7± 7.4）個；而正常人分離血小板血管分支數約為（129.8±10.1）個（F=128.687，P＜0.05）。由此可見tumstatin轉基因血小板與正常血小板和未轉染血小板不同，能夠顯著抑制內皮細胞管狀結構的形成，進而推測在體內有可能抑制腫瘤新生血管形成，見圖4。

圖2 流式細胞術檢測小鼠體內血小板A：輸注后第3天；B：輸注后第5天；C：輸注后第7天

圖3 血小板免疫熒光染色 ×1 000 A：轉基因血小板熒光染色；B：非轉基因血小板熒光染色；1：tumstatin蛋白抗體染色；2：VWF蛋白抗體染色；3：1和2的合成圖

圖4 各組血管分支數比較1：非轉基因血小板組；2：tumstatin轉基因血小板組；3：正常人分離血小板組；與tumstatin轉基因血小板組比較：*P＜0.05

2.5 血小板聚集試驗檢測轉基因血小板的聚集功能 小鼠外周血小板和正常人血小板在加入凝血酶之前均呈現相似的分散狀態，待加入凝血酶后均發生了聚集反應（圖5）。結果表明tumstatin轉基因巨核細胞產生的血小板同正常血小板一樣均能對凝血酶產生聚集反應，具有血小板聚集功能。

圖5 血小板聚集實驗結果　×400A：正常人富血小板血漿中獲得的血小板的聚集實驗；B：培養液的上清富集的血小板樣顆粒物質聚集實驗；1：加入凝血酶前；2：加入凝血酶后

3 討論

化療是臨床治療惡性腫瘤的重要手段，但大劑量的化療容易導致血小板減少癥，嚴重影響了腫瘤的治療效果和進程［5-6］。目前，臨床主要采取直接血小板輸注，以及利用體外擴增的造血干細胞和誘導分化產生的巨核細胞輸入體內促進血小板生成，但近些年研究［7-8］顯示，惡性腫瘤的發生和發展往往伴隨著血小板數量的增多和（或）活性的明顯升高，二者呈正相關性。

腫瘤細胞通過產生血小板活化因子，如組織因子、凝血酶和二磷酸腺苷等激活血小板并釋放到血液循環中，使其聚集在腫瘤血管處發生脫顆粒反應，隨后激活鄰近的血小板，現已證實多種腫瘤血管處存在活化的血小板。血小板在血管受損處或細胞高度增殖處受激活釋放目的蛋白，可使局部達到較高的有效濃度。正常情況下，表達蛋白在血小板內部不與外界接觸，不僅避免了抗體的產生，也避免了血液中蛋白酶的作用而導致降解。血小板的天然貯存、運輸和釋放功能，有理由認為血小板是潛在的腫瘤靶向治療載體。

tumstatin是近年發現的來源基底膜Ⅳ型膠原α3鏈C末端非膠原區的內源性新生血管生成抑制因子，其通過特異性抑制內皮細胞蛋白的合成來抑制腫瘤新生血管的形成，從而抑制腫瘤的生長和轉移。體內外實驗［9-10］證明tumstatin是通過特異性結合腫瘤血管內皮細胞表面上調的αvβ3整合素受體（主要是β3）抑制內皮細胞蛋白質合成，其抗血管生成能力至少是endostatin的10倍。血小板膜糖蛋白gpⅡb/Ⅲa（整合素αⅡbβ3）和αvβ3屬于整合素家族β3組（血小板糖蛋白組），在介導“癌細胞-血小板-內皮細胞”的黏附中作用十分關鍵，阻斷gp Ⅱb/Ⅲa和使用抗αvβ3抗體都能抑制癌細胞與血管內皮細胞的黏附［11］。因此，tumstatin除了特異性作用腫瘤新生血管內皮細胞外還有可能通過β3功能性受體阻斷血小板介導癌細胞與血管內皮細胞的黏附。

國外有研究［12］已證實經血小板生成素誘導生成的巨核細胞在體外14～21 d時大部分都已經凋亡，因此在體外擴增巨核細胞進行體內回輸時培養天數不宜超過14 d，以避免輸注無效的巨核細胞。作為本實驗的動物模型，NOD/SCID鼠是在SCID小鼠與NOD/Lt小鼠雜交的雙突變小鼠，既有T和B淋巴細胞缺乏，又具有表達NK細胞活性相對低的特性，各種腫瘤細胞可以植入，且較少發生排斥反應及移植物抗宿主病，利于進行人巨核細胞輸注和動物模型的構建。

通過慢病毒介導在血小板中過表達血管生成抑制因子tumstatin，有針對性地將目的蛋白輸送到靶點，證明其在小鼠體內能夠產生具有抗血管生成作用的血小板，為tumstatin轉基因血小板抑制腫瘤的生長和轉移提供了可靠依據。該方法不僅有可能解決化療藥物引起的血小板減少癥和輸注常規血小板引起的促進腫瘤新血管生長的弊端，更具有基因治療的優勢，如治療腫瘤針對性強、具有很高的靶向性、具有非細胞毒性等，這將成為一個有效的生物相容性的基因傳遞系統。另外，基因修飾的巨核細胞體內不能永久生存，輸注巨核細胞不會引起人體基因突變，這有可能使基因治療聯合化療發揮更大的抗腫瘤效果。值得注意的是，對癌細胞具有目標特異性的血小板，在來源的選擇上具有靈活性，比如可以使用患者自身的血小板作為目的蛋白表達的輸送載體，這不僅保證了安全性，也避免了機體免疫反應的影響。本研究在腫瘤治療中具有一定潛力，有待于進一步研究證實。

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Tum statin transgenic m egakaryocyte produce anti-angiogenesis p latelet in NOD/SCID m ice

Ren Huirong1，Luo Yiqin1，Li Juan2，et al
（1Clinical Laboratory，2Dept of Blood Transfusion，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To investigate tumstatin transgenic megakaryocyte producing platelets in NOD/SCID mice and its anti-angiogenesis fuction.Methods Tumstatin transgenic megakaryocyte was injected into NOD/SCID mice，and mice peripheral blood was regularly taken.Flow cytometry was used to test transgenic platelets production；immunofluorescence was used to test the expression of tumstatin；endothelial cells tubular structure formation testwas used to test anti-angiogenesis fuction；platelet aggregation testwas used to test aggregation function.Results After 3 d of transgenic megakaryocyte infusion，human platelets could be detected in peripheral blood of NOD/SCID mice，and the tumstatin expression was observed in platelets，which could obviously inhibit the endothelial cells tubular structure formation and kept nomal aggregation function.Conclusion Tumstatin transgenic megakaryocyte can produce anti-angiogenesis platelets having normal aggregation function in NOD/SCID mice，which lays the foundation for further anti-tumor research.

tumstatin；megakaryocyte；platelets；NOD/SCID mice

R 7336；R 331.2

A

1000-1492（2016）04-0511-05

2016-01-08接收

安徽省自然科學基金（編號：11040606M209）；安徽省教育廳自然科學研究項目（編號：KJ2011A163）

安徽醫科大學附屬省立醫院1檢驗科、2輸血科，合肥230001

任薈蓉，女，碩士研究生；羅以勤，男，副教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：luoyiqin2003@163.com