陰囊短暫、輕度熱處理對小鼠睪丸應激反應的影響

劉洪茂，穆柯瀚，姬艷麗，2，張 君，張桂彬，劉 路，王 華，徐德祥

◇預防醫學研究◇

陰囊短暫、輕度熱處理對小鼠睪丸應激反應的影響

劉洪茂1，穆柯瀚1，姬艷麗1，2，張 君3，張桂彬3，劉 路3，王 華3，徐德祥3

目的 探討單次、短暫、輕度熱處理（43℃、15 min）對小鼠睪丸的應激反應。方法 將24只成年ICR雄性小鼠隨機分為4組。將熱處理組小鼠身體的下1/3部分浸于43℃恒溫水浴中15 min，于熱處理后0.5、2、6 h取睪丸組織。將對照組小鼠身體的下1/3部分浸入22℃水浴15 min，6 h后取睪丸組織。采用Western blot法檢測睪丸總蛋白熱休克蛋白32（HO-1）、3-硝基酪氨酸（3-NT）和葡萄糖調節蛋白78（GRP78）的表達；采用免疫組化法檢測GRP78的表達。結果 HO-1為熱應激的標志物，在熱處理后，睪丸HO-1表達顯著上調（P＜0.01），并呈時間依賴性。3-NT為蛋白質硝化標志物，熱處理明顯增強睪丸組織蛋白的硝化（P＜0.01）。此外，與對照組比較，熱處理下調內質網應激標志物GRP78在睪丸中的表達（P＜0.05）。結論 單次短暫輕度陰囊熱處理明顯誘導睪丸組織HO-1和3-NT表達，而下調GRP78表達，提示熱應激、硝化應激和內質網應激可能參與了短暫、輕度陰囊熱處理誘導的睪丸損傷。

陰囊熱應激；睪丸；熱應激；硝化應激；內質網應激

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：01 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.028.htm l

男性不育是一項亟待解決的重大公共衛生問題。影響男性精液質量下降的因素有很多，其中職業環境與男性不育的相關性已成為公眾關注的一項新的研究熱點。研究［1］顯示高溫作業或洗桑拿浴的成年男子生育力明顯降低，研究［2］證實陰囊溫度略有增加就能夠干擾精子發生甚至導致不育，然而目前關于熱對男性生殖功能影響的分子機制尚不清楚。研究［3］表明低氧應激和氧化應激在熱誘導的睪丸生殖細胞損傷中起重要作用。該研究主要探討單次、短暫、輕度陰囊熱處理（43℃、15 min）對小鼠睪丸熱應激、硝化應激和內質網應激的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級ICR小鼠24只（8周齡、雄性、28～35 g），購自安徽省實驗動物中心。小鼠于實驗前適應性喂養1周。實驗遵循國家科學技術部頒布的《中華人民共和國實驗動物管理條例》，盡量減少實驗動物使用的數量和減少實驗動物的痛苦，禁止虐待動物。

1.2 化學試劑 聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Millipore公司；化學發光增強檢測試劑盒購自美國 Pierce公司；熱休克蛋白32（heat shock protein 32，HO-1）、3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）抗體購自美國SantaCruz公司；葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體購自北京博奧森科技有限公司。

1.3 動物處理 24只小鼠隨機分為對照組、0.5 h組、2 h組和6 h組。將熱處理組小鼠身體的下1/3部分（包括陰囊、后腿、尾巴）浸于43℃恒溫水浴中15 min，于熱處理后0.5、2、6 h剖殺。將對照組小鼠身體的下1/3部分浸入22℃水浴中15 min，于6 h后剖殺取睪丸組織，采用Western blot法檢測睪丸總蛋HO-1、3-NT和GRP78的表達；采用免疫組化法檢測睪丸組織GRP78的表達。

1.4 睪丸組織切片 取小鼠一側完整包膜未破損的睪丸，置于4%MDF液（含30%甲醛、15%乙醇、5%冰乙酸及50%三蒸水）固定。每組分別制備不同小鼠HE染色切片，經無水乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5μm連續切片、HE染色、光學樹脂封片，在光學顯微鏡下觀察睪丸組織病理學變化并拍照。

1.5 TUNEL檢測 采用TUNEL方法檢測睪丸組織生殖細胞凋亡。每組選取睪丸組織石蠟切片各6張，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化、浸洗、細胞通透、平衡液反應15 min、TUNEL反應混合液濕盒37℃孵育1 h、浸入2×SSC 15 min以終止反應、浸洗、封閉內源性過氧化物酶，進行酶標記反應30 min，最后用DAB進行顯色、蘇木精復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明和中性樹膠封片。經TUNEL染色后凋亡細胞核染成深綜色或深褐色。

1.6 W estern blot法檢測睪丸組織HO-1、3-NT、GRP78表達 每孔上45μg蛋白，進行垂直電泳（濃縮膠電壓50 V，分離膠電壓115 V）3 h，再以平行電泳的方式將凝膠中的蛋白條帶轉移到PVDF膜上。轉移有蛋白的 PVDF膜在5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜。PVDF膜分別用一抗［β-actin（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、3-NT（1∶1 000）、GRP78 （1∶1 000）］室溫孵育2～3 h。用含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液溶液洗滌3次，每次10 min，洗滌后的PVDF膜用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h。采用增強化學發光試劑盒進行發光檢測、壓片，膠片用掃描儀掃描后采用IPP軟件分析目的條帶的光密度值，進行定量分析。Western blot分析中將目的蛋白的表達水平用內參β-actin進行標化，將對照組標化后的比值定為1。

1.7 免疫組化法檢查睪丸組織蛋白表達 參考文獻［4］：本實驗采用免疫組化多聚物（PV-9001）法檢測GRP78的表達情況。取睪丸病理切片進行常規脫蠟至水化，用3%H2O2封閉內源性過氧化物酶15 min；將切片放入枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）中，微波加熱進行抗原修復，山羊血清封閉處理20 min，一抗GRP78封閉過夜，相應的二抗處理，DAB顯色處理，蘇木精復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察GRP78的分布及表達情況。

1.8 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，數據以±s表示。采用單因素方差分析檢驗各組之間的差異有無統計學意義。

2 結果

2.1 熱處理對小鼠睪丸組織病理的影響 對照組小鼠睪丸內生精小管內細胞排列緊密，層次均較清晰（圖1A）。與對照組比較，熱處理所引起的睪丸損傷非常明顯，單次熱應激處理2 h后睪丸生殖細胞細胞核濃縮（圖1B），而熱處理后6 h病理改變進一步加重，表現為睪丸組織生精小管間隙增大，生精小管內細胞排列紊亂，細胞核濃縮細胞明顯增多，并可見多核巨細胞（圖1C）。

2.2 熱誘導睪丸生殖細胞凋亡 采用TUNEL法進行凋亡分析。結果顯示，對照組TUNEL+生殖細胞很少（圖2A1、A2），在熱處理后2 h睪丸TUNEL+生殖細胞明顯增多（圖2B1、B2）。而熱處理后6 h TUNEL+生殖細胞進一步增多，且TUNEL+細胞主要為精原細胞和初級精母細胞，含TUNEL+生殖細胞的生精小管數量明顯增加（圖2C1、C2）。

2.3 熱處理對小鼠睪丸HO-1蛋白表達的影響

HO-1是一種重要的熱應激蛋白標志物。本研究探討了單次、短暫、輕度陰囊熱處理對小鼠睪丸組織HO-1蛋白表達的影響。結果顯示，正常小鼠睪丸組織中也能檢測到HO-1蛋白的表達。與對照組比較，熱處理能明顯上調HO-1蛋白的表達，并呈時間效應關系（F=122.23，P＜0.01），見圖3。

2.4 熱處理對小鼠睪丸3-NT蛋白表達的影響 3-NT是一個特異的蛋白質硝化標志物。本次研究結果表明：單次、短暫、輕度陰囊熱處理能夠顯著誘導睪丸3-NT的表達（F=200.47，P＜0.01），見圖4，提示熱處理能夠引起睪丸組織發生硝化應激。

2.5 熱處理對小鼠睪丸GRP78表達的影響

圖1 陰囊熱處理對小鼠睪丸組織病理學的影響 HE×100A：對照組；B：2 h組；C：6 h組；↑：細胞核濃縮細胞；?：支持細胞空泡；*：多核巨細胞；?：胞質與細胞核消融的細胞

GRP78是一個重要的內質網分子伴侶。采用Western blot法探討單次、短暫、輕度陰囊熱處理對小鼠睪丸組織GRP78蛋白表達的影響。結果顯示，與對照組比較，熱處理后6 h組GRP78的表達明顯降低（F=13.28，P＜0.05），見圖5。進一步采用免疫組化法分析小鼠睪丸組織GRP78蛋白的表達，結果顯示，對照組GRP78主要在精原細胞和初級精母細胞表達，在Sertoli細胞、Leydig細胞、圓形及長形精子細胞中幾乎沒有 GRP78表達（圖6A），而熱處理后6 h組GRP78的表達明顯降低（圖6C），與Western blot結果相一致（圖5）。

圖2 陰囊熱處理對小鼠睪丸生殖細胞凋亡的影響 DABA：對照組；B：2 h組；C：6 h組；1：×100；2：×200；↑：TUNEL+生殖細胞；*：含有TUNEL+的生精小管；?：多核精細胞

圖3 陰囊熱處理對睪丸組織　HO-1表達的影響1：對照組；2：0.5 h組；3：2 h組；4：6 h組；與對照組比較：**P ＜0.01

圖4 陰囊熱處理對睪丸組織3-NT表達的影響1：對照組；2：0.5 h組；3：2 h組；4：6 h組；與對照組比較：**P ＜0.01

3 討論

本研究將小鼠下腹部浸于43℃恒溫水浴中15 min，能夠引起明顯的睪丸病理損傷，誘導睪丸生殖細胞凋亡。本研究進一步探討了熱處理對小鼠睪丸熱應激、硝化應激和內質網應激的影響。

HO-1是一種重要的熱應激蛋白標志物［5-6］，此外HO-1的誘導與氧化應激和低氧應激也有關聯。當細胞和組織處于應激狀態時，HO-1可作為保護性蛋白被誘導，以對抗各種應激所引起的損傷。本課題組前期研究［7-8］顯示，鎘顯著誘導睪丸組織HO-1的表達。本實驗結果顯示：陰囊熱處理明顯上調睪丸HO-1的表達，并具有明顯的時間效應關系，提示單次、短暫、輕度陰囊熱處理誘導睪丸組織發生熱應激反應。實驗［6］表明HO-1可以在各種應激損傷中起到保護作用，但也有不同的觀點認為HO-1過度表達在一些疾病的發生發展中起了作用。本研究結果表明熱處理能明顯上調睪丸HO-1的表達，但這種表達具有保護作用還是促進作用目前尚不清楚。

硝化應激指機體內活性氧簇與活性氮簇生成增加導致機體內產生大量硝化能力極強的一類硝化物質，對機體內的一些蛋白質產生硝化作用或者對細胞的核酸物質產生硝化作用，進而引起一些機體的病理變化［9］。蛋白質酪氨酸硝化可以導致一些酶的失活，影響酪氨酸磷酸化調節的信號傳導，通過改變細胞的細微結構導致細胞凋亡。3-NT是蛋白質硝化的主要產物，被認為是硝化應激的標志蛋白，在多種疾病中都伴隨著3-NT水平的升高［7-8，10］。本研究結果顯示，陰囊熱處理能夠時間依賴性地誘導3-NT的表達，提示熱處理引起睪丸組織發生硝化應激。

內質網是細胞內重要的細胞器，蛋白質和脂質合成、加工、折疊和運輸均在內質網進行。當細胞內質網受損或蛋白質合成增加即引起內質網應激，誘導未折疊蛋白質反應［11-12］。內質網蛋白質加工和包裝需要內質網特異性分子伴侶的協助，其中GRP78是最常見的內質網特異性分子伴侶。本研究顯示陰囊熱處理能夠抑制睪丸組織GRP78的表達，提示熱處理引起睪丸組織發生內質網應激。

圖5 陰囊熱處理對睪丸組織GRP78表達的影響1：對照組；2：0.5 h組；3：2 h組；4：6 h組；與對照組比較：*P＜0.05

圖6 免疫組化檢測睪丸組織中　GRP78的表達分布 PV二步法×100 A：對照組；B：2 h組；C：6 h組

綜上所述，單次、短暫、輕度陰囊熱處理能夠引起睪丸組織發生復雜的應激反應，包括熱應激、硝化應激和內質網應激，然而這些應激反應在熱誘導的睪丸組織損傷中的作用尚需要進一步探討。以上研究結果也進一步證實，環境溫度與男性生殖健康密切相關，長時間在高溫環境下工作的男性應加強保護措施，注意自我防護，避免職業高溫因素對男性精液質量產生的不良影響，預防男性不育的發生。

［1］ Garolla A，TorinoM，Sartini B，etal.Seminalandmolecularevidence that sauna exposure affects human spermatogenesis［J］. Hum Reprod，2013，28（4）：877-85.

［2］ Kanter M，Aktas C，Erboga M.Heat stress decreases testicular germ cell proliferation and increases apoptosis in short term：an immunohistochemical and ultrastructural study［J］.Toxicol IndHealth，2013，29（2）：99-113.

［3］ Paul C，Teng S，Saunders P T.A single，mild，transient scrotal heat stress causes hypoxia and oxidative stress in mouse testes，which induces germ cell death［J］.Biol Reprod，2009，80（5）：913-9.

［4］ 夏玲玲，周仲松，謝琴秀，等.白芍總苷對糖尿病大鼠肝臟內質網應激的調節作用［J］.安徽醫科大學學報，2015，50 （10）：1451-5.

［5］ Pae H O，Chung H T.Heme oxygenase-1：its therapeutic roles in inflammatory diseases［J］.Immune Netw，2009，9（1）：12-9.

［6］ Solano M E，Arck P C.Heme oxygenase-1：for better，for worse，in sickness and in health［J］.Oncotarget，2015，6（17）：14733 -4.

［7］ Ji Y L，Wang H，Meng C，et al.Melatonin alleviates cadmiuminduced cellular stress and germ cellapoptosis in testes［J］.JPineal Res，2012，52（1）：71-9.

［8］ JiY L，Wang H，Zhao X F，etal.Crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mitochondrial pathway mediates cadmium-induced germ cell apoptosis in testes［J］.Toxicol Sci，2011，124 （2）：446-59.

［9］ Mayo JN，Beard RSJr，Price TO，etal.Nitrative stress in cerebral endothelium ismediated bymGluR5 in hyperhomocysteinemia ［J］.JCereb Blood Flow Metab，2012，32（5）：825-34.

［10］Abdelmegeed M A，Jang S，Banerjee A，etal.Robustprotein nitration contributes to acetaminophen-induced mitochondrial dysfunction and acute liver injury［J］.Free Radic Biol Med，2013，60：211-22.

［11］Brewer JW.Regulatory crosstalk within the mammalian unfolded protein response［J］.Cell Mol Life Sci，2014，71（6）：1067-79.

［12］Gardner B M，Pincus D，Gotthardt K，et al.Endoplasmic reticulum stress sensing in the unfolded protein response［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2013，5（3）：a013169.

Effect of transient scrotal hypertherm ia on testicular stress response in m ice

Liu Hongmao1，Mu Kehan1，Ji Yanli1，2，et al
（1Dept of Occupational and Environmental Health，2Dept of Inspection and Quarantine Health，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To evaluate the stress response in mouse testes following a singlemild transient scrotal heat exposure（43℃ for 15 min）.Methods Twenty-four male mice were random ly divided into four groups and there were six animals in each group.Mice in scrotal hyperthermia groupswere subjected to a single heat stress of 43℃（treated）for 15 min and killed at 0.5，2，and 6 h after heat exposure.Controlmice were immersed in a water bathmaintained at22℃ for 15 min and killed at6 h after exposure.The expressions of testicular heat shock protein 32（HO-1），3-nitrotyrosine（3-NT）and glucose-regulated protein 78（GRP78）protein were measured using Western blot.Testicular GRP78 was also identified by immunostaining.Results HO-1，a stress-inducible enzyme，expressed at a low level in the testes，was significantly increased in a time-dependentmanner in testes ofmice exposed to scrotal hyperthermia（P＜0.01）.The intensity of3-NT，amarker of protein nitration，was obviously aggravated in testes of heat-treated mice（P＜0.01）.In addition，scrotal hyperthermiamarkedly reduced protein level of testicular GRP78（P＜0.05）.Conclusion A single，acute scrotal hyperthermia significantly induces the expression of testicular HO-1 and 3-NT，and reduces the protein level of GRP78.These results suggest that heat stress，nitrative stress and endoplasmic reticulum stressmay contribute to scrotal hyperthermia-induced testicular impairment.

scrotal hyperthermia；testis；heat stress；nitrative stress；endoplasmic reticulum stress

R 134.3；R 114

A

1000-1492（2016）04-0521-05

2015-12-25接收

國家自然科學基金（編號：31000664、31571557）；安徽醫科大學2011年博士科研資助項目（編號：XJ201114）；安徽醫科大學“青年拔尖人才支持計劃”；高等學校省級特色專業建設點項目（編號：2013tszy010）

安徽醫科大學公共衛生學院1勞動衛生與環境衛生學系、2衛生檢驗與檢疫學系、3衛生毒理學系，合肥230032

劉洪茂，男，碩士研究生；姬艷麗，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：jiyanlidev@126.com