橙皮素衍生物Y12抗炎活性評價

田遠耀，李 俊，黃 成，孟曉明，程亞卉

◇藥學研究◇

橙皮素衍生物Y12抗炎活性評價

田遠耀，李 俊，黃 成，孟曉明，程亞卉

目的 篩選出具有較好抗炎活性的橙皮素衍生物Y12（HY-12）并對其抗炎活性進行評價。方法 脂多糖（LPS）刺激RAW262.7細胞株產生炎癥因子，ELISA法測定細胞株分泌腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）的水平，從而篩選出能抑制細胞因子TNF-α和IL-6生成、具有較好抗炎活性的HY-12；采用三種炎癥模型：二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠誘導小鼠足腫脹、弗氏完全佐劑所致小鼠佐劑性關節炎（AA），觀察HY-12的抗炎活性。結果 篩選出HY-12具有較好的抗炎活性；HY-12（100、200、400 mg/ kg）對二甲苯致小鼠耳廓急性炎癥有不同程度的抑制作用，HY-12（200、400 mg/kg）能顯著抑制小鼠耳腫脹；HY-12（100 mg/kg）在3 h和5 h對小鼠足腫脹有明顯的抑制作用，HY-12（200、400 mg/kg）于致炎后1 h開始產生療效，在各個時間點均有明顯的抑制作用；HY-12對小鼠AA模型的炎癥反應也有一定的抑制作用，HY-12（400mg/kg）對AA小鼠的繼發側足腫脹、血清炎癥因子、局部炎癥浸潤以及滑膜組織TNF-α、IL-6有一定的抑制作用。核轉錄因子-κB亞單位p65的磷酸化在炎癥反應中起著重要的調控作用，結果顯示加藥組磷酸化p65表達水平低于模型組。結論 HY-12具有較強的抗炎活性，其抗炎作用可能與調控NF-κB通路活性有關。

HY-12；小鼠；耳腫脹；足腫脹；佐劑性關節炎

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：01 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.030.htm l

橙皮素是二氫黃酮的一種，其藥理作用有：抗氧化［1］、抑制炎性介質［2］、降血脂、通過刺激某些線粒體酶（如琥珀酸脫氫酶等）保護內皮細胞組織的低氧、避免氧化等因素引起的基因突變導致的癌變［3］。雖然橙皮素具有很好的生物利用度，但由于其半衰期較短，口服給藥后消除較快，需要通過頻繁給藥來維持血藥濃度，這就限制了其在臨床上的應用。為了克服這一缺點，本課題組通過化學合成的方法，合成了一系列的橙皮素衍生物并對其進行體外抗炎活性的篩選，希望以此得到具有更好抗炎活性且較母體藥物橙皮素具有更長半衰期的新型藥物單體。該研究選取小鼠腹腔巨噬細胞系RAW264.7，模擬體內巨噬細胞炎癥反應，篩選出能較好抑制RAW264.7分泌炎癥因子的橙皮素衍生物Y12（HY-12），并通過兩種急性模型（二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠誘導小鼠足腫脹）以及一種慢性模型［弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant，FCA）所致佐劑性關節炎（adjuvant-induced arthritis，AA）］初步評價其抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 動物 普通級昆明種小鼠192只，雌雄各半，18～22 g，由安徽省實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 HY-12和橙皮素（安徽醫科大學藥學院石靜波博士合成并測定含量＞99%）；阿司匹林（華中藥業股份有限公司）；二甲苯（上海蘇懿化學試劑公司，批號20120210）；角叉菜膠（美國Sigma公司）；小鼠腹腔巨噬細胞系RAW264.7（上海細胞庫）；DMEM培養基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）置于-20℃冰箱保存，56℃水浴滅活30 min后使用；DMSO、FCA（美國Gibco公司）；腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（上海拜力生物科技有限公司）；TNF-α、IL-6、核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor，NF-κB）亞單位p65磷酸化（p-p65）一抗（美國Cell Signaling公司）；Western blot二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 主要儀器 足腫脹測量儀（荷蘭雷勃公司）；NAPCO-6100型細胞培養箱（美國SHELLAB公司）；Western blot電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.4 方法

1.4.1RAW264.7細胞的培養取凍存的RAW264.7細胞，37℃水浴快速解凍，加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養基，將細胞放于37℃、5%CO2的培養箱中培養，6 h后更換培養基，細胞生長2 d后，按一定比例傳代培養。

1.4.2 RAW264.7細胞培養液上清中TNF-α和IL-6的檢測 取對數期生長的細胞以5×104/cm2接種于24孔板中，待細胞生長至80%，分別加入不同的藥物刺激細胞，每組3個復孔。實驗分組為正常組、模型組［脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）1μg/ m l］、HY-12（12.5、25、50、100、200μmol/L）、橙皮素組（200μmol/L）和陽性藥組（阿司匹林1 mg/ m l）。藥物作用24 h后，取細胞上清液，1 000 r/min離心15 min，收集上清液，ELISA法測定上清液中炎癥因子TNF-α和IL-6的含量。

1.4.3 二甲苯誘導小鼠耳腫脹模型的制備與檢測［4］昆明種小鼠48只，雌雄各半，隨機分為6組：正常組、模型組、HY-12（100、200、400 mg/kg）組、陽性藥組（阿司匹林45 mg/kg）。灌胃給藥，連續3 d ［HY-12在使用前以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）混懸制備成相應濃度］，正常組和模型組給予相應體積的CMC-Na。末次給藥后1 h在小鼠左耳前后兩面均勻涂抹二甲苯50μl（除正常組外），右耳作對照，1.5 h后處死小鼠，沿耳廓邊剪下兩耳，用9 mm的打孔器在兩耳同一部位打下兩圓耳片，用電子天平稱重，計算腫脹度和抑制率。腫脹度以每鼠左右耳片重量差來表示，抑制率（%）=（模型組耳腫脹-給藥組耳腫脹）/模型組耳腫脹×100%。

1.4.4 角叉菜膠誘導小鼠足腫脹模型的制備與檢測 昆明小鼠48只，雌雄各半，隨機分為6組：正常組、模型組、HY-12（100、200、400 mg/kg）組、陽性藥組（阿司匹林45 mg/kg）。灌胃給藥，連續3 d，正常組和模型組給予相應體積的CMC-Na。末次給藥后，除正常組外每鼠右足趾皮下注射0.1 m l角叉菜膠（10 mg/m l），于致炎后1、3、5 h用足腫脹測量儀測量致炎側足容積，腫脹度為各鼠足爪致炎前后容積差。

1.4.5 FCA所致小鼠AA模型的制備與檢測［5］

昆明小鼠96只，雌雄各半，隨機分為6組：正常組、模型組、HY-12（100、200、400 mg/kg）組、陽性藥組（阿司匹林45 mg/kg）。除正常組外于每組小鼠左后足趾皮內注射0.02 m l FCA致炎，正常組小鼠注射同體積的生理鹽水。

1.4.5.1 FCA所致小鼠AA足腫脹測量 在致炎前和致炎后第7、14、21、28天分別測定小鼠右側足爪容積，腫脹度=致炎后容積-致炎前容積。致炎后第14天，小鼠繼發性關節炎出現（肉眼觀察改變以及腫脹度提示關節炎發生）。從第14天開始，除正常組和模型組外每只小鼠灌胃給予一定劑量藥物，連續14 d，正常組和模型組給予等體積的CMCNa。

1.4.5.2 FCA所致小鼠AA血清炎癥因子以及組織病理變化 檢測第28天腹主動脈取血，1 500 r/ min離心15 min取血清，ELISA法測定TNF-α和IL-6含量。取小鼠膝關節，固定48 h后，EDTA脫鈣處理30 d，HE染色，觀察小鼠繼發側炎癥浸潤。

1.4.5.3 FCA所致小鼠AA滑膜組織炎癥因子檢測 第28天處死小鼠，取約100 mg膝關節滑膜組織，經液氮研磨提取組織蛋白，Western blot法檢測組織TNF-α、IL-6和p-p65的表達。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，數據均以±s表示。組間比較采用 One-Way ANOVA檢驗。所有檢驗為雙側檢驗。

2 結果

2.1 HY-12對LPS刺激的RAW 264.7細胞炎癥因子TNF-α和IL-6分泌的影響 與正常細胞比較，LPS刺激小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α和IL-6明顯升高，見表1。加藥組與模型組比較，陽性藥組可以明顯抑制LPS刺激的TNF-α和IL-6分泌，并且HY-12的高濃度組（100、200μmol/L）對LPS刺激的TNF-α和IL-6分泌也有明顯的抑制作用，且與橙皮素組比較，效果更好。表明HY-12能抑制LPS刺激的RAW264.7細胞炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌，具有一定的抗炎活性。

表1 HY-12對LPS刺激的RAW 264.7細胞炎癥因子分泌的影響（ng/L，±s）

表1 HY-12對LPS刺激的RAW 264.7細胞炎癥因子分泌的影響（ng/L，±s）

與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別　TNF-αIL-6正常659.77±11.04　52.54±5.57模型　823.96±25.32*　87.67±1.81*HY-12（μmol/L）200　651.57±30.03##　44.74±5.94##100　667.15±15.26##　50.98±4.90#50　776.42±19.11　77.72±10.42 25　801.35±27.84　77.96±2.79 12.5　829.82±19.37　75.20±6.28陽性藥　594.21±20.62##　42.23±0.62##橙皮素　680.37±18.53#　52.42±3.84##

表2 HY-12對角叉菜膠誘導小鼠足腫脹的影響（ml，n=8，±s）

表2 HY-12對角叉菜膠誘導小鼠足腫脹的影響（ml，n=8，±s）

與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

組別1 h　3 h　5 h正常0.087±0.061　0.069±0.032　0.110±0.077模型　0.419±0.071　0.476±0.119　0.385±0.127 HY-12（mg/kg）100　0.314±0.108　0.408±0.037　0.347±0.053 200　0.249±0.072*　0.292±0.090*　0.298±0.086 400　0.194±0.062**　0.227±0.098*　0.328±0.122*陽性藥　0.182±0.095*　0.204±0.118**　0.282±0.094*

2.2 HY-12對角叉菜膠誘導小鼠足腫脹的影響角叉菜膠致炎后1 h，小鼠足跖開始出現明顯紅、腫等變化，約3 h達高峰。HY-12（200、400 mg/kg）于致炎后1 h開始產生療效，其中HY-12（400 mg/kg）在各個時間點均有明顯的抑制作用。見表2。

2.3 HY-12對二甲苯誘導小鼠耳腫脹的抑制作用

HY-12（100、200、400 mg/kg）對二甲苯致小鼠耳廓急性炎癥有不同程度的抑制作用，其中HY-12 （200、400 mg/kg）組與模型組比較差異有統計學意義。見表3。

表3 HY-12對二甲苯誘導小鼠耳腫脹的抑制作用（n=8，±s）

表3 HY-12對二甲苯誘導小鼠耳腫脹的抑制作用（n=8，±s）

與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

組別　耳腫脹（mg）　抑制率（%）1.32±0.63　-模型　19.57±3.21　-HY-12（mg/kg）100　16.32±2.18*　16.61 200　15.17±4.66*　22.48 400　14.79±3.57**　24.42陽性藥　14.45±2.58**正常26.16

2.4 HY-12對FCA所致小鼠AA的影響

2.4.1 HY-12對FCA所致小鼠AA足腫脹的影響

模型組小鼠右后足腫脹在致炎后第14天開始出現繼發腫脹。HY-12組小鼠從致炎后開始發揮作用，HY-12（400 mg/kg）可明顯抑制致炎后第28天小鼠的繼發性足腫脹。見表4。

2.4.2 HY-12對FCA所致小鼠AA血清TNF-α和 IL-6水平的影響 與正常組比較，模型組致炎后第28天小鼠血清TNF-α和IL-6明顯升高。第14天給予小鼠HY-12（100、200、400 mg/kg），結果顯示HY-12（200、400 mg/kg）組能明顯抑制小鼠血清TNF-α 和IL-6的水平，以HY-12（400 mg/kg）組抑制作用最為明顯。見表5。

2.4.3 HY-12對FCA所致小鼠AA膝關節病理改變的影響 模型組小鼠膝關節HE染色顯示大量炎性細胞浸潤，大量脂肪空泡，而且滑膜組織侵蝕到軟骨及骨組織中，關節腔輪廓較不規則。HY-12組小鼠炎癥浸潤相對較少，關節腔輪廓相對較為清楚。其中HY-12（400 mg/kg）組炎癥浸潤明顯少于模型組，與陽性藥組基本相當。見圖1。

圖1 小鼠膝關節　HE染色　×40A：正常組；B：模型組；C：HY-12（100 mg/kg）組；D：HY-12（200 mg/kg）組；E：HY-12（400 mg/kg）組；F：陽性藥組

2.4.4 HY-12對FCA所致小鼠AA組織炎癥因子水平的影響 模型組小鼠滑膜組織TNF-α和IL-6的表達水平明顯高于正常組，給予HY-12灌胃后，滑膜組織TNF-α和IL-6的表達水平下降，其中以HY-12（400 mg/kg）組最為明顯。在HY-12組p-p65也較模型組表達降低。見圖2。

3 討論

該研究通過檢測HY-12體外抑制LPS刺激的RAW264.7分泌TNF-α和IL-6的作用，篩選出具有較好抗炎活性的化合物HY-12。TNF-α是一種系統性炎癥的細胞因子，同時也是引起急性反應的眾多細胞因子中的一員，主要來自巨噬細胞分泌。其能夠促使發熱，引起細胞凋亡，誘導產生IL-1和IL-6從而引發炎癥。TNF-α表達失調與許多人類疾病有關，包括阿爾茨海默病、癌癥、重度抑郁障礙和腸炎［6］。IL-6是一種多效應炎癥因子，主要由單核巨噬細胞、內皮細胞及淋巴樣細胞分泌產生。IL-6在急性期反應、免疫應答、造血調節中發揮著重要作用，是造血源細胞、B細胞、T細胞、內皮細胞等的重要分化和生長因子［7］。然而過量表達IL-6往往與某些疾病密切相關，將造成組織損傷［8］。結果顯示，HY-12高濃度組（100、200μmol/L）對于 LPS刺激的TNF-α和IL-6的分泌具有明顯的抑制作用，且與母體藥物橙皮素比較，效果更好。因此HY-12具有抑制LPS刺激的TNF-α和IL-6的分泌作用。

表4 HY-12對　FCA誘導小鼠AA足腫脹的影響（m l，n=8，±s）

表4 HY-12對　FCA誘導小鼠AA足腫脹的影響（m l，n=8，±s）

與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別　第7天　第14天　第21天　第28天正常　0.071±0.050　0.083±0.022　0.121±0.034　0.108±0.229模型　0.051±0.033　0.138±0.057　0.219±0.032*　0.249±0.025*HY-12（mg/kg）100　0.050±0.047　0.125±0.068　0.154±0.067　0.198±0.035 200　0.064±0.028　0.117±0.016　0.133±0.073　0.140±0.044#400　0.063±0.040　0.094±0.054　0.127±0.043　0.131±0.550##陽性藥　0.060±0.035　0.109±0.049　0.132±0.040　0.126±0.570##

表5 HY-12對　FCA誘導小鼠AA炎癥因子的影響（ng/L，n=8，±s）

表5 HY-12對　FCA誘導小鼠AA炎癥因子的影響（ng/L，n=8，±s）

與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05；##P＜0.01

組別　TNF-αIL-6正常550.333±25.324　18.384±1.623模型　854.667±21.877**　71.897±8.246*HY-12（mg/kg）100　786.833±8.808　57.590±2.314 200　739.000±8.846#　36.308±5.390#400　621.333±19.035##　27.744±2.195#陽性藥　602.167±13.137##　27.590±1.880#

圖2 小鼠膝關節滑膜組織　TNF-α、IL-6、p-p65蛋白表達水平A：正常組；B：模型組；C：HY-12（100 mg/kg）組；D：HY-12（200 mg/kg）組；E：HY-12（400 mg/kg）組；F：陽性藥組；與正常組比較：*P ＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠誘導小鼠足腫脹是兩種常見急性非特異性炎癥模型。二甲苯模型主要機制是致使某些炎癥介質如組胺、激肽和纖維蛋白溶解釋放，引起局部血管擴張，毛細血管通透性增加，炎癥細胞浸潤，造成耳部急性滲出性炎癥水腫［9］。足腫脹模型是一個常用于評價或篩選藥物抗炎作用的經典的急性炎癥模型，當給小鼠足跖內注射角叉菜膠時能產生局部毛細血管擴張、血管通透性增高、滲出、水腫等反應。結果均表明，HY-12對二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠誘導的小鼠足腫脹具有抑制作用，并且中、高兩個劑量組的作用均有顯著作用，其中高劑量組和陽性藥作用相當。提示，HY-12具有較好的抗炎活性。

小鼠AA模型是一種免疫性炎癥模型，繼發性病變表現為多發性關節炎癥，為篩選評價抗炎與免疫藥物的常見模型。研究［10］表明，AA發病過程中存在細胞因子網絡的失調，促炎因子（IL-1、IL-6、TNF-α）和抑炎因子（IL-10）的不平衡占有重要地位，其中TNF-α與AA疾病活動相關，參與多種病理過程，如增強內皮細胞黏附分子的表達；產生膠原酶，導致骨的破壞。此外，IL-6也是AA中主要的炎癥介質，IL-6主要是誘導肝細胞分泌急性期蛋白并誘導其他炎癥因子如IL-1和TNF-α的產生而發揮致病作用。在AA發生發展過程中，NF-κB是最為重要的炎癥通路之一［11］。NF-κB通路的活化可以促進更多炎癥因子表達水平以及發揮作用，包括促炎因子和抗炎因子［10］。結果均表明，HY-12能抑制AA小鼠的血清TNF-α、IL-6的水平。在局部膝關節，HY-12能抑制滑膜組織的炎癥浸潤，以及對滑膜組織增生，破壞軟骨及骨組織也有一定的抑制作用。另外，Western blot結果也顯示，HY-12組滑膜組織的TNF-α、IL-6水平也較模型組低。其中高劑量組TNF-α、IL-6水平明顯低于模型組。HY-12抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的表達可能是通過調控NF-κB的活化實現的。

［1］ Ren D Y，Xu T，Li R，et al.5，7，3′-Triacetyl hesperetin suppresses adjuvant-induced arthritis in rats through modulating JAK2 /STAT3 pathway［J］.Am JChin Med，2013，41（3）：601-14.

［2］ 朱思明，于淑娟，楊連生，等.橙皮苷-銅（Ⅱ）配合物的配位模式和橙皮苷的抗氧化機理［J］.天然產物研究與開發，2006，18（3）：386-9.

［3］ Nandakumar N，Rengarajan T，Balamurugan A，etal.Modulating effects of hesperidin on key carbohydrate-metabolizing enzymes，lipid profile，and membrane-bound adenosine triphosphatases against7，12-dimethylbenz（a）anthracene-induced breast carcinogenesis［J］.Hum Exp Toxicol，2014，33（5）：504-16.

［4］ 彭 磊，張 茜，李 榮，等.橙皮苷衍生物抗炎活性的篩選研究［J］.安徽醫科大學學報，2011，46（1）：36-9.

［5］ 李 榮，李 俊，胡成穆，等.橙皮苷對大鼠佐劑性關節炎的治療作用及機制［J］.中國藥理學通報，2008，24（4）：494-8.

［6］ 龍武彬，劉 建，董 巍，等.血清新蝶呤、IL-1、TNF-α聯合檢測對類風濕關節炎活動性診斷價值的探討［J］.現代預防醫學，2010，37（13）：2590-2.

［7］ 張德忠，溫建艷，季偉鋒，等.類風濕性關節炎患者IL-6、IL-18 和CRP的水平變化及意義［J］.放射免疫學雜志，2009，22 （2）：155-7.

［8］ 王 勇，滕義建，李前防.類風濕關節炎患者SAA、IL-6水平及意義［J］.吉林醫學，2010，31（35）：6476.

［9］ Wang SJ，Tong Y，Lu S，et al.Anti-inflammatory activity ofmyricetin isolated from Myrica rubra Sieb.et Zucc.leaves［J］.Planta Med，2010，76（14）：1492-6.

［10］Ledeboer A，Gamanos M，Lai W，et al.Involvement of spinal cord NF-κB activation in ratmodels of proinflammatory cytokinemediated pain facilitation［J］.Eur J Neurosci，2005，22（8）：1977-86.

［11］楊玉榮，佘銳萍，梁宏德.Toll-NF-kB信號途徑及其介導的功能［J］.細胞生物學雜志，2007，29（4）：483-6.

The evaluation of hesperidin derivatives Y-12 anti-inflammatory activity

Tian Yuanyao，Li Jun，Huang Cheng，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Anhui Provincial Laboratory on Bioactivity of Natural Products，Anhui Provincial Engineering Research Center on Active Components of Natural Products，Hefei230032）

Objective To screen out the derivativewith better anti-inflammatory activity of Hesperidin.And itsanti-inflammatory activity was also evaluated then.Methods We stimulated RAW 264.7 cell strainswith lipopolysaccharide（LPS）and then inflammation cytokines tumor necrosis factor alpha（TNF-α）and interleukin 6（IL-6）weremeasured by ELISA.And the anti-inflammatory activity was evaluated on three inflammationmodels（mice ear swelling induced by xylol，mice foot swelling induced by carrageen glue and mice adjuvant-induced arthritis.Resu lts Derivatives of hesperidin 12（HY-12）had better anti-inflammatory activity；HY-12（100，200，400 mg/ kg）on acute inflammation induced by xylene in mice auricle had different degree of inhibition，HY-12（200，400 mg/kg）dose group could significantly inhibit the ear swelling inmice；HY-12（100mg/kg）in 3 h，5 h had obviously inhibitory effectonmice foot swelling，HY-12（200，400 mg/kg）in inflammatory started producing curative effect after 1 h，at all time points itwas significantly inhibited.HY-12 also had certain inhibition to inflammation of rheumatoid arthritismousemodel.HY-12 400 mg/kg could significantly inhibit the secondary side paw swelling，serum inflammatory factors，local inflammatory infiltration and the expression of TNF-αand IL-6 in synovial tissues of adjuvant-induced arthritismice.And nuclear factor kappaB p65 played gets amajor role in regulation of inflammation response.Conclusion The above results show that HY-12 has strong anti-inflammatory activity through regulating the activation of NF-κB.

derivatives of hesperidin；mice；ear swelling；foot swelling；adjuvant-induced arthritis

R 285.25

A

1000-1492（2016）04-0526-05

2015-12-21接收

國家自然科學基金（編號：81473268、81273526）；安徽省科技攻關計劃項目（編號：1301042212）；安徽省自然科學基金（編號：1308085MH145）

安徽醫科大學藥學院，安徽省天然藥物活性研究重點實驗室，安徽省天然藥物活性成分工程技術研究中心，合肥230032

田遠耀，男，碩士研究生；李 俊，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lijun@ ahmu.edu.cn