肝細胞癌組織中Shh、Gli1、Snail、E-cadherin表達的臨床研究

倪卓然，謝 坤，趙紅川，朱立新，耿小平

◇臨床醫學研究◇

肝細胞癌組織中Shh、Gli1、Snail、E-cadherin表達的臨床研究

倪卓然1，謝 坤1，趙紅川1，朱立新2，耿小平1

目的 探討Shh、Gli1、Snail及E-cadherin在肝細胞癌組織中的表達及意義。方法 應用免疫組化法檢測91例肝癌組織、癌旁組織及30例正常肝組織中Shh、Gli1、Snail及E-cadherin的表達情況，結合臨床資料，分析其對預后的影響。結果 Shh、Gli1、Snail及E-cadherin在肝癌組織和癌旁組織及正常肝組織中的表達程度差異均有統計學意義（P＜0.05），肝癌組織中前3者表達高于癌旁組織及正常肝組織，E-cadherin在正常肝組織中的表達高于癌旁組織（P＜0.05）；4種蛋白的表達均與肝癌直徑、分化程度、有無脈管癌栓相關（P＜0.05）；4種蛋白的表達與年齡、性別、術前血清甲胎蛋白水平、乙肝表面抗原陽性、腫瘤單發或多發、肝硬化與否均無相關性；Shh、Gli1和Snail兩兩之間在肝癌組織中的表達呈正相關性（P＜0.05），而這3個蛋白表達均與E-cadherin呈負相關性（P＜0.05）。Shh、Gli1及E-cadherin在肝癌組織陽性表達程度與預后相關，而Snail在肝癌組織和癌旁組織同時表達則提示預后不良。結論 Hedgehog信號通路與上皮間質轉換過程在肝癌組織中均異常活躍，提示異常激活的Hedgehog信號通路可能通過引起轉錄因子的異常表達而調控上皮間質轉化發生，從而影響肝細胞癌的發生發展。

肝細胞癌；Hedgehog信號通路；上皮間質轉換

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：01 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.034.htm l

上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transtion，EMT）是一種基礎的生理病理現象，目前被認為是腫瘤轉移的重要機制之一，與肝細胞癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）的侵襲轉移更密切相關［1］。Hedgehog信號通路是胚胎發育過程中重要的調控信號，研究［2］表明Hedgehog信號通路分子在HCC等多種腫瘤上存在異常表達，可能參與了HCC的發生發展。有關Hedgehog通路和EMT在HCC侵襲轉移中的相互作用及其作用機制尚不明確。該研究選用Hedgehog信號通路中Shh和Gli1兩個關鍵轉錄因子，以及EMT中Snail及E-鈣黏蛋白（E-cadherin）兩個標志的轉錄因子，分析其表達與HCC臨床病理特點、預后及相互之間的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料 隨機選取2007年6月～2012年6月安徽醫科大學第一附屬醫院肝膽外科手術根治切除或活檢組織的91例肝癌組織、癌旁組織及30例正常者肝組織，患者術前均未行放化療，每例標本皆經病理確診。HCC組：男85例，女6例；年齡21～78歲，中位年齡52歲；腫瘤平均直徑為1.4～15.0 cm，中位直徑為5.9 cm；分化類型：低分化20例，中高分化52例，高分化19例；重度肝硬化16例，中重度肝硬化35例，輕度肝硬化35例，無肝硬化5例；乙肝表面抗原（HBsAg）陽性表達84例，HBsAg陰性表達7例；血清甲胎蛋白升高（＞25 ng/ml）53例，血清甲胎蛋白正常（≤25 ng/ml）38例；有脈管癌栓24例，無脈管癌栓67例；腫瘤單發24例，多發67例。收集所有病例肝癌組織及癌旁組織標本（距離癌組織邊緣2 cm以上），收集同時期活檢病理證明為正常肝臟組織標本30例。所有患者通過電話或傳真長期隨訪，相關資料錄入肝膽外科康寧隨訪系統中。

1.2 主要試劑 兔來源Shh抗體、Gli1抗體、Snail抗體、E-cadherin抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；非生物素超敏二步法免疫組織化學檢測試劑盒（PV6000）、3，3-二氨基聯苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，PBS沖洗3次，每次3 min，檸檬酸緩沖液微波熱修復抗原，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶10 min，PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS后，滴加50μl一抗4℃過夜。Shh蛋白稀釋度為1∶50，Gli1蛋白為1∶150，Snail蛋白為1∶100，E-cadherin蛋白為1∶150，用武漢博士德公司提供的已知人乳腺癌切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照，PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS液，滴加50μl生物素標記的二抗，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS液，DAB顯色1 min，自來水沖洗3 min終止反應，蘇木精對比復染、脫水、透明、封片。

1.4 結果判斷 普通光學顯微鏡下每張切片隨機選取5個高倍鏡視野觀察細胞，細胞內出現棕黃或棕褐顆粒為陽性細胞，根據陽性細胞染色強以及陽性細胞在總細胞中所占比例判定實驗結果。無著色為0分；淡黃色為1分；黃色為2分；棕褐色為3分。陽性細胞率計分標準：陽性細胞＜5%為0分；5%～25%為1分；＞25%～50%為2分；＞50%～75% 為3分；＞75%為4分。總評分值（陽性細胞率評分乘以著色強度評分）≤3分為陰性，＞3分為陽性。疾病特異性總生存期（overall survial，OS）定義為從手術日到肝癌至死亡或末次隨訪的時間。無瘤生存期（disease free survial，DFS）定義為是從手術日到影像學證實腫瘤復發時。

1.5 統計學處理 應用SPSS 19.0軟件進行分析，數據采用χ2檢驗及Fisher確切概率法。相關性分析采用Spearman相關分析。生存數據進行Kaplan-Meier分析，并繪制生存曲線，應用Log-rank檢驗差異性。

2 結果

2.1 Shh、G li1、Snail及E-cadherin表達情況 Shh

主要表達于胞質，胞膜也見表達（圖1A），肝癌組織顯著高于癌旁組織及正常肝組織（χ2=19.976、7.329，P=0.001、0.007），正常肝組織與癌旁組織差異無統計學意義；Gli1主要在胞質、胞核表達（圖1B），肝癌組織顯著高于癌旁組織和正常肝組織（χ2=19.07、10.32，P=0.001、0.001），正常肝組織與癌旁組織差異無統計學意義；Snail主要表達于胞質、胞核亦見少量表達（圖1C），肝癌組織高于癌旁組織及正常肝組織（χ2=22.10、14.59，P=0.001、0.001），正常肝組織與癌旁組織差異無統計學意義；E-cadherin主要在胞膜、胞質表達（圖1D），肝癌組織顯著低于癌旁組織及正常肝組織（χ2=43.62， P＜0.001），而癌旁組織顯著低于正常肝組織，差異有統計學意義（χ2=9.143，P=0.002）。見表1。

2.2 Shh、Gli1、Snail及E-cadherin的表達與肝癌臨床病理特征的關系 Shh、Gli1及Snail在HCC中的陽性表達與腫瘤直徑、脈管癌栓和分化程度存在相關性，表現為隨著腫瘤直徑增大、存在脈管癌栓時和（或）腫瘤分化程度較差時Shh、Gli1和Snail陽性表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。E-cadherin在HCC中的陽性表達同樣與腫瘤直徑、脈管癌栓和分化程度存在相關性，隨著直徑增加、脈管癌栓時和（或）腫瘤分化程度較差，E-cadherin陽性表達減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，E-cadherin的表達在肝臟是否硬化上差異有統計學意義（P=0.020）。4種蛋白在肝癌組織中的表達與患者性別、年齡、甲胎蛋白水平、腫瘤單發或多發、肝硬化與否無明顯關系，見表2。

圖1 肝癌組織中蛋白表達情況 SP×400A：Shh陽性表達；B：Gli1陽性表達；C：Sanil陽性表達；D：E-cadherin陰性表達

表1不同組織中　Shh、G li1、Snail、E-cadherin陽性表達率［n（%）］

2.3 肝癌組織中Shh、G li1、Snail及E-cadherin表達的相互關系Shh、Gli1、Snail、E-cadherin在HCC中的表達同樣經配對資料Spearman相關分析顯示Shh與Gli1和Snail的表達呈正相關性（r=0.369、0.333，P＜0.01），Shh與E-cadherin的表達呈負相關性（r=-0.358，P＜0.01），E-cadherin與Gli1和Snail的表達呈負相關性（r=-0.227、-0.260，P＜0.05），Gli1與Snail的表達呈正相關性（r=0.246，P ＜0.05）。表2 Shh、Gli1、Snail及E-cadherin的表達與肝癌臨床病理特征的關系（n）

臨床病理特征　n Shh陽性　P值Gli1陽性　P值Snail陽性　P值E-cadherin陽性　P值0.691　0.079　0.761　0.876 ＞52　44 28　21　22　9 ≤52　47 28　31　25　9性別　0.789　0.223　0.076　0.389 男85 52　50　46　16 女6 4　2　1　2術前甲胎蛋白（ng/ml）　0.659　0.244　0.313　0.185 ＞25　53 36　33　25　8 ≤25　38 20　19　22　10血清HBsAg　0.290　0.210　0.203　0.111 （-）7 3　2　2　3 （+）　84 53　50　45　15硬化　0.942　0.894　0.592　0.020 無5 3　3　2　3 有86 53　49　45　15腫瘤數目　0.547　0.410　0.774　0.655 1 24 16　12　13　4 ＞1　67 40　40　34　14腫瘤直徑（cm）　0.009　0.029　0.016　0.024 ＞3　47 35　32　30　6 ≤3　44 21　20　17　12分化程度　＜0.001　0.001　0.007　＜0.001 高20 5　5　5　16中、低　71 51　47　42　2脈管癌栓　0.039　0.003　0.028　0.025 有24 19　20　17　1無年齡（歲）67 37　32　30　17

2.4 Shh、Gli1、Snail及E-cadherin表達與預后的關系 本組HCC患者經電話或短信長期隨訪，隨訪率94.5%。本組患者癌組織中Shh、Gli1、Snail及E-cadherin陽性表達分別是56、52、47、18例。當Shh、Gli1陰性表達時，患者DFS的中位數分別是陽性表達患者的1.31倍（34個月/26個月）、2.21倍（42個月/19個月），而OS的中位數分別是陽性表達患者的1.72倍（50個月/29個月）、1.81倍（47個月/ 26個月），3年生存率（70.6%、66.7%）也顯著高于陽性表達患者（49.1%、44.2%），見圖2。Shh和Gli1的陽性表達率與患者的生存狀態呈正相關性，差異有統計學意義（P＜0.05），提示預后不良。E-cadherin陽性表達時，患者的DFS的中位數（34個月）及OS的中位數（47個月）、3年生存率（83.3%）顯著優于陰性表達患者的DFS中位數（26個月）、OS中位數（37個月）、3年生存率（50.7%），提示E-cadherin陽性表達可能是較好預后的影響因素之一。Snail在肝癌組織中表達與預后無明顯相關性，但當Snail在肝癌組織和癌旁組織同時表達陽性時（19/91，20.88%），Snial的表達與DFS及OS均有相關性（P＜0.05），見圖3。

圖2 肝癌組織中Shh與　G li1表達與否的生存曲線A：DFS；B：OS

圖3 肝癌組織中　E-cadherin與肝癌、癌旁組織中Snail中同時表達與否的生存曲線A：DFS；B：OS

3 討論

原發性肝癌在2014年成為世界范圍內第五大最常見的惡性腫瘤，也是第二大最常見致死性惡性腫瘤，嚴重危害人類健康。我國是HCC的高發區域，每年發病患者數達30多萬，占世界肝癌患者的60%［3］。目前仍然缺乏高敏感性的早期診斷方法，而且HCC早期極易發生肝內外轉移，多數患者就診時已為中晚期，即使行根治性切除或肝移植仍易早期復發，預后極差。

近年來，人們在包括肝癌的多種腫瘤模型中均發現了EMT現象。EMT是指在特定的生理和病理情況下上皮細胞向間質細胞轉化的現象，是胚胎發育中形態發生過程的重要部分，在成人體內，EMT參與多種疾病發展，包括組織器官的纖維化和腫瘤的發生和發展，目前被認為是腫瘤轉移的重要機制之一，其與HCC的發生發展密切相關［1］。鋅指轉錄因子Snail首先在果蠅中被發現，是參與EMT調控的重要轉錄因子，Snail通過抑制E-cadherin轉錄表達，誘導EMT發生［4］。E-cadherin廣泛存在于各種上皮細胞中，介導同型細胞連接的鈣依賴性黏附分子，是主要的抑制上皮腫瘤轉移基因，而E-cadherin表達的下調是EMT的最重要標志之一［5］。Hedgehog通路由Hedgehog配體、2個跨膜蛋白受體Ptch和Smo以及下游轉錄因子Gli蛋白等組成，而Shh 和Gli1基因和蛋白的表達水平是反映Hedgehog信號通路活性的可靠指標［6］。既往研究［7］表明，當肝臟發育成熟后Hedgehog信號通路轉入靜息狀態，但Hedgehog信號通路分子在多種腫瘤上異常表達，例如基底細胞癌、胰腺癌和膽管癌等，因此，認為Hedgehog信號通路與腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移密切相關［8-9］。

本研究結果顯示，Snail在肝癌組織表達明顯高于癌旁組織和正常肝組織，與肝癌的腫瘤直徑、脈管癌栓、分化程度呈現相關性。當腫瘤直徑越大、分化程度越差和（或）有脈管癌栓時，Snail表達增高；E-cadherin的表達則正好相反。當腫瘤伴有微血管侵犯時，E-cadherin表達低于無血管侵犯。此外，E-cadherin陽性表達率不僅在肝癌組織與癌旁組織存在顯著性差異，且癌旁組織與正常肝臟組織也存在顯著性差異。本研究顯示Snail與E-cadherin呈明顯負相關性，Snail在肝癌組織及癌旁組織同時陽性表達組的DFS及OS顯著低于陰性組，E-cadherin在肝癌組織陽性表達組的DFS及OS顯著高于陰性組，提示肝組織中Snail的表達可能直接調控肝癌組織及癌旁組織E-cadherin的表達，通過降低肝癌組織及癌旁組織E-cadherin的表達，破壞細胞間的緊密連接，致使細胞間黏附力減弱或喪失，導致EMT發生，進而促進肝癌的復發和轉移。在動物模型及肝癌標本研究［10-11］中也得出相似的結論。

本研究結果顯示，Shh和Gli1表達呈正相關性。Shh在肝癌組織的表達明顯高于癌旁組織和正常肝組織。且隨著腫瘤分化程度的增高而減少，低分化組陽性率顯著高于中、高分化組。此外，Shh在肝癌伴脈管癌栓組中表達顯著高于無脈管癌栓組。Gli1的表達水平與Shh得出相似的結論。本實驗結果提示Hedgehog信號通路的異常活化可能參與了肝癌的發生發展，并且與腫瘤的直徑、分化程度及微血管侵犯有著密切的關系，直接影響肝癌的生物學行為，并顯著影響患者手術切除預后。

在HCC的研究中，Hedgehog通路異常活化與癌細胞EMT及侵襲力相關，表現為在 Hedgehog通路活化的肝癌細胞中，用阻滯劑環巴胺阻斷該通路后，腫瘤的EMT現象及腫瘤細胞遷移受限［12］。在本研究中，Shh、Gli1、Snail及E-cadherin蛋白在肝組織中的陽性表達，直接影響患者預后。而Shh、Gli1 和Snail3者之間在肝癌中的表達呈正相關性，而這3個蛋白的表達與E-cadherin呈負相關性，提示異常激活的Hedgehog通路可能參與了調控Snail、E-cadherin的表達，通過調控EMT的發生，促進肝癌的發生發展。而隨著研究的進展，肝癌中Hedgehog通路調節EMT過程的機制愈發明晰，靶向干涉或阻斷Hedgehog通路，或將為肝癌的臨床治療提供一個更為廣闊的應用前景。

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Conclusion Hedgehog signaling pathway and epithelial-mesenchymal transition（EMT）process in liver cancer tissues are hyperactive，prompting the abnormal activation of the Hedgehog signaling pathwaymay lead to the abnormal expression of EMT by regulating the expression of transcription factors，thus affect the incidence and development of HCC.

Clinical research of Shh，G li1，Snail，E-cadherin expression in hepatocellular carcinoma tissues

Ni Zhuoran，Xie Kun，Zhao Hongchuan，et al
（Deptof General Surgery，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To appraise the expression of Shh，Gli1，Snail and E-cadherin in hepatocellular carcinoma （HCC）tissue and its significance.Methods The expression of Shh，Gli1，Snail and E-cadherin proteins in 91 cases of HCC tissues，pericarcinous tissues and 30 cases of normal human liver tissueswere detected by using immunohistochemical technology，then to analyze its influence on prognosis combined with clinical data.Results Shh，Gli1，Snail and E-cadherin were expressed statistically significant among HCC tissues，pericarcinous tissues and normal tissues（P＜0.05），While Shh，Glil，Snail expressionswere higher in HCC group than in pericarcinous tissues group and normal tissues group.By contrast，E-cadherin expression was higher in pericarcinous tissues than in normal tissues，but lower than in HCC tissues（P＜0.05）.All proteins expression was correlated with tumor differentiation，tumor size，and vascular tumor emboli（P＜0.05），and was not correlated with age，gender，preoperative serum AFP level，positive serum HBsAg，single ormultiple tumors，liver cirrhosis.Shh，Gli1 and Snail expressed in HCC was positively correlated with each other（P＜0.05），butwas negatively correlated with E-cadherin（P＜0.05）.The prognosis and overall survivalwere correlated with the expression of Shh，Gli1，E-cadherin protein，it indicated poor prognosis when Snail expressed positive both in carcinoma and pericarcinous tissues.

hepatocelluar carcinoma；hedgehog signaling pathway；epithelial-mesenchymal transition

R 657.3

A

1000-1492（2016）04-0536-06

2015-12-21接收

安徽省衛生廳醫學科研重點項目（編號：2010A009）

安徽醫科大學第一附屬醫院1普外科、2中心實驗室，合肥230022

倪卓然，男，碩士研究生；
耿小平，男，主任醫師，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：xp_geng@163.net