85株兒童感染金黃色葡萄球菌耐藥性及流行病學研究

夏小榮，熊玉玲，朱玉林，王亞亭

85株兒童感染金黃色葡萄球菌耐藥性及流行病學研究

夏小榮，熊玉玲，朱玉林，王亞亭

目的 了解安徽省各地區近年兒童感染金黃色葡萄球菌（SA）耐藥性及其流行病學特征，分析耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的葡萄球菌盒式染色體（SCCmec）基因型分布特點，為臨床感染和控制提供依據。方法 臨床分離2010年～2013年每年9月非重復的兒童SA共85株，利用Microscan Walk-Away-40全自動微生物分析儀進行細菌鑒定和藥敏試驗，MRSA經瓊脂倍比稀釋法進行表型篩選、聚合酶鏈反應（PCR）最終確定。多重PCR法檢測MRSA SCCmec基因分型。結果 85株SA中檢出19株MRSA和66株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA），MRSA的檢出率為22.35%。MRSA檢出率最多的標本是痰液及咽拭子，其次為分泌物。全部SA對青霉素、克林霉素完全耐藥，未發現萬古霉素耐藥及中介的菌株。與MSSA藥敏結果比較，MRSA對16種常用抗菌藥物的耐藥性更高。MRSA SCCmec分型以SCCmecⅢ最多見，共12株，其次為SCCmec I5株，未分型2株，未發現SCCmecⅡ、Ⅳ、Ⅴ型。結論 本地區兒童感染SA有不同的耐藥譜，兒童MRSA對同種抗菌藥物耐藥率均高于MSSA。兒童臨床分離的MRSA菌株其SCCmec基因型以Ⅲ型為主。臨床應合理使用抗菌藥物，定期監測耐藥性變遷，避免院內傳播。

兒童；金黃色葡萄球菌；耐藥性；葡萄球菌盒式染色體；聚合酶鏈反應

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：02 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.054.htm l

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是兒科院內及社區感染重要的病原菌，其感染嚴重、病情多樣變化、病死率高，給臨床治療帶來了巨大困難。由于抗菌藥物的廣泛使用，兒童耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcusaureus，MRSA）感染分離率正逐年升高，細菌耐藥性已成為臨床上抗感染領域的嚴峻問題。為了解安徽省地區兒童感染SA對抗菌藥物的耐藥性及MRSA基因型分布特征，對2010年～2013年每年9月安徽省各地區醫院兒童臨床標本中分離的85株SA進行藥敏試驗，并采用多重聚合酶鏈反應（PCR）法分析MRSA分離株的基因分型。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及質控菌株 85株SA收集自2010年～2013年每年9月安徽省細菌耐藥中心監測網41所醫院臨床分離的非重復送檢標本。質控菌株為安徽省細菌耐藥監控中心標準菌株SA ATCC 25923、ATCC 29213和ATCC 43300（mecA陽性菌株）。

1.2 儀器、試劑和培養基 Microscan Walk-Away-40全自動微生物分析儀購自美國DADE公司；PCR儀器購自德國Biometra公司；凝膠成像系統購自上海天能科技有限公司；多點接種儀購自英國AQS Manufacturing公司；電熱恒溫箱購自上海精宏公司；M-H瓊脂培養基購自英國Oxiod公司；葡萄球菌溶菌素購自大連寶生物公司；PCR試劑盒：dNTP、Ex-Taq酶、Buffer、瓊脂糖、DL 600、DL 2000等均購自上海生物工程公司。

1.3 抗菌藥物 青霉素、苯唑西林、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻肟、亞胺培南、美羅培南、萬古霉素、替考拉林、環丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、氯霉素、利福平、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素共19種抗生素均購自中國藥品生物制品檢定所，均在有效期內使用。

1.4 藥敏試驗 采用瓊脂倍比稀釋法對分離株進行藥物敏感性檢測，結果判定按照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2013版指南標準［1］進行判定。

1.5 PCR法鑒定MRSA及SCCmec的多重PCR擴增分型 根據美國臨床實驗室標準協會標準，應用PCR法對SA菌株進行耐藥基因的擴增即mecA基因，每次PCR均有 ATCC 43300陽性對照、ATCC 29213陰性對照及雙蒸水作為空白對照，見圖1。經藥敏試驗及PCR鑒定MRSA，其SCCmec復合擴增引物反應條件參考Zhang et al［2］的報道并做適當改變。SCCmec基因分型引物由上海生工工程有限公司合成，PCR引物序列及產物長度見表1。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像系統觀察，并切取有效片段經上海生工工程有限公司測序，見圖2。測序結果在Genbank比對，比對結果確定其為擴增產物，見圖3。

圖1 部分MRSA基因分型圖譜M：Marker；1～7：受試　MRSA菌株；8：陽性對照菌株　ATCC 43300；9：陰性對照菌株 ATCC 29213；10：雙蒸水對照

圖2 部分 MRSA的 SCCmec多重PCR分型圖譜M：Marker；1～3：SCCmecⅠ型的　MRSA；4～8：SCCmecⅢ型的MRSA

圖3 測序圖A：mecA；B：SCCmecⅠ型；C：SCCmecⅢ型

1.6 統計學處理 SA的分布及藥敏數據采用SPSS 16.0軟件進行分析，兩組的比較采用χ2檢驗。

表1 PCR擴增引物序列

2 結果

2.1 MRSA分離情況 2010年～2013年每年9月共收集兒童金黃色葡萄球菌85株，其中MRSA 19株，檢出率為22.35%（19/85）。

2.2 SA標本分離來源、病區分布及年齡分段 兒童SA標本主要來源最多見為痰液及咽拭子，占52.95%，分泌物次之為11.82%；經統計學分析表明，兩標本來源所占比例比較差異有統計學意義（χ2=21.502，P＜0.05），見表2。病區分布多見于普兒內科，占43.53%，其次為兒外科為32.94%，兩科室所占比例比較差異有統計學意義（χ2=4.243，P＜0.05），見表3。年齡段來源多見于嬰幼兒，占51.77%，學齡期兒童次之為27.27%，兩年齡段所占比例比較有統計學意義（χ2=13.306，P＜0.05），見表4。

表2 MSSA與MRSA臨床標本來源構成比［n（%）］

2.3 SA的藥敏結果分析 85株SA均對青霉素和克林霉素100%耐藥；對頭孢曲松、頭孢他啶、大環內脂類耐藥率高，為50.59%～82.35%；對氯霉素、左氧氟沙星、苯唑西林等耐藥性較低，為20.00%～36.74%；對亞胺培南、利奈唑胺等耐藥率低，為9.41%～15.29%；未發現對萬古霉素耐藥株。除青霉素、克林霉素和萬古霉素外，MRSA與MSSA對其余16種抗菌藥物均有不同程度耐藥，且MRSA的耐藥率均高于MSSA，見表5。

表3 MSSA與MRSA臨床科室分布構成比［n（%）］

表4 M SSA與　MRSA年齡段來源分類構成比［n（%）］

表5 M RSA與　MSSA對常見抗菌藥物的耐藥性

2.4 MRSA的SCC基因分型結果 19株MRSA分離株SCCmec分型共有Ⅰ、Ⅲ型兩型，其中Ⅲ型為最常見的SCCmec型，占63.16%（12/19）；其次是Ⅰ型，占26.32%（5/19）；未分型的2株，占分離株的10.53%（2/19）。

3 討論

隨著抗菌藥物的廣泛使用，兒童SA感染的分離率呈逐年上升趨勢，是醫院感染的重要病原菌，并常有暴發流行的報道。本研究結果顯示，我省兒童MRSA分離率為22.35%，與近年國內文獻［3-6］報道的兒童感染資料相近。朱德妹等［3］對國內主要地區14所教學醫院（12所綜合性醫院、2所兒童醫院）臨床分離的SA菌株采用統一方案進行細菌藥敏試驗，報道［3-7］顯示MRSA居歷年革蘭陽性菌分離株的首位，2010年報道上述醫院共收集SA 4 452株，MRSA的平均檢出率為51.7%（11.5% ～77.6%），兒童專科醫院MRSA的檢出率為11.5% ～24.5%［4］。2011年報道 SA 6 000株，MRSA平均檢出率為50.6%（20.2%～85.3%），兒童為20.2% ～27.7%［5］。2012年報道SA 7 339株，MRSA平均檢出率為47.9%（18.4%～82.9%），兒童為18.4% ～29.4%［6］。2013年報道 SA 8 127株，MRSA平均檢出率為45.2%（23.8%～72.0%），兒童為23.8% ～37.6%［7］。不同地區或醫院間、成人和兒童MRSA的檢出率比較有差異，可能與用藥習慣、標本來源、研究菌株例數、研究方法等密切相關。

本研究顯示，安徽省各級醫院收集分離的85株SA主要分離自呼吸道標本痰液和咽拭子，占所有臨床送檢標本的52.95%。其次為分泌物，占18.82%，其他來源標本占28.23%。提示臨床上要加強對兒童患者呼吸道感染好發部位的監測與護理，是預防與控制臨床感染的重要途徑。從臨床來源各科室分布看來，兒內科和兒外科尤其骨科檢出率居多，分別為43.53%和 32.94%，提示加強醫院里重點高危科室的綜合管理，對防止SA醫院內感染的爆發流行極為重要。從年齡段分布來看，SA所致的感染在學齡前期（3～6歲）較少，所占比例為4.71%，而在嬰幼兒和學齡期兒童多見，分別為51.77%和27.05%。這與兒童的年齡特點相關，嬰幼兒的自身免疫功能尚未發育成熟，皮膚黏膜等非特異性免疫屏障功能薄弱，抗感染能力較差，易發生各種感染，而學齡期兒童經常參加比較劇烈的體育運動或戶外活動，外傷后易繼發感染［8］。

藥敏結果顯示，85株SA未發現對萬古霉素耐藥株，對替考拉林、美羅培南、亞胺培南耐藥率低，表明這些藥物是SA感染患兒治療首選和有效的藥物，臨床在使用時應做好耐藥性監測，避免濫用。氯霉素、利福平、左氧氟沙星、慶大霉素耐藥率較低，表明這些藥物對SA仍具有較好的抗菌活性，提示這些抗菌藥物在藥敏結果未出來而SA感染較重時，可以優先考慮使用，待藥敏結果再行調整。大環內酯類、克林霉素、頭孢他啶、頭孢曲松耐藥率高，表明目前這些抗菌藥物已不適用于治療SA引起的兒童感染。本研究SA藥敏結果與李穎豐等［9］報道藥敏結果相比較顯示，兩者都對萬古霉素完全敏感，對青霉素完全耐藥，其次對亞胺培南、美羅培南的耐藥率低，而對其他抗菌藥物的耐藥率均有所增高。

本實驗藥敏結果進一步顯示，MRSA和MSSA對苯唑西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟、環丙沙星、慶大霉素耐藥率比較，差異均有統計學意義。這些抗菌藥物對MSSA有較好的治療效果，而對MRSA耐藥率高，所以在未確定SA是否為MRSA的情況下，臨床上不建議首選這些抗菌藥物。頭孢他啶、大環內酯類抗菌藥物在兩組中比較差異無統計學意義；這些抗菌藥物耐藥率均在50%以上，無論SA是否為MRSA，臨床上均不予考慮使用。利福平、左氧氟沙星、氯霉素等其他7種抗菌藥物的耐藥率均在50%以下，表明在臨床SA感染較重時而藥敏結果未歸時，可以考慮使用這些抗菌藥物。臨床上在確診SA感染時，應區別對待MRSA和MSSA，根據藥敏結果及時、合理使用抗菌藥物預防和控制感染。

目前認為MRSA的耐藥機制是MSSA在獲得了SCCmec元件，此SCCmec元件上mecA基因編碼產生青霉素結合蛋白（PBP2a），對β-內酰胺類抗菌藥物的親和力降低，從而產生對抗菌藥物的耐藥［10］。在世界不同地區MRSA菌株攜帶的SCCmec類型的流行趨勢亦不盡相同，亞洲地區MRSA菌株攜帶Ⅱ型SCCmec基因型主要見于日本和韓國，其他大多數地區MRSA菌株以攜帶Ⅲ型的SCCmec［11］為主。我國各地學者［12-14］對當地分離的MRSA SCCmec基因檢測分析結果表明，我國分離的MRSA攜帶的SCCmec基因型也以Ⅲ型為主，同時也有不同比例的其他類型SCCmec存在。本研究對所檢測的19株 MRSA進行SCCmec擴增分型，結果表明SCCmecⅢ型的MRSA為12株，SCCmec I型的MRSA為5株，未分型的2株，說明引起本地區感染的MRSA以SCCmecⅢ型為主，和國內報道一致。

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Antim icrobial resistance and epidem iology of 85 isolates of Staphylococcal aureus infection in paediatrics

Xia Xiaorong，Xiong Yuling，Zhu Yulin，et al
（Dept of Paediatrics，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the antimicrobial resistance and the epidemiological characteristics of Staphylococcusaureus（SA）.To analyze themethicillin-esistant SA（MRSA）staphylococcal cassette chromosome（SCCmec）genotype distribution characteristics，so as to provide evidence for clinical infection and control.Methods A total of85 clinical isolatesof SA were consecutively collected from different clinical significance specimens，and were excluded the repeated isolates from the same patients.All isolates SA and drug sensitivity testwere identified by the Microscan Walk-Away-40 automaticmicroorganism analyzer.The MRSA wasmade by agar dilutionmethod for phenotype screening and further identified by polymerase chain reaction（PCR）.The genotypes of SCCmec were determined bymultiplex PCR.Resu lts Of 85 strains isolated SA，there were 19 strains MRSA and 66 strainsmethicillin sensitive SA（MSSA）.The detection rate ofMRSA was22.35%.Themain detection rate ofMRSA specimens was sputum and throat swab，followed by secretions.All SAwere completely resistant to penicillin and childamycin，but entirely sensitive to vancomycin.Compared with MSSA，the drug resistance of16 common antimicrobial agengts was higher than that of MRSA.SCCmec genotyping results showed that themost frequent SCCmec type wasⅢ.The 12 isolates of MRSA were SCCmecⅢ，only 5 isolateswere SCCmecⅠ，and 2 isolates had no genotype.TypeⅡ，typeⅣand typeⅤwere not found in the group.Conclusion There are different resistance patterns of SA in the local area.The rates of drug resistance of MRSA for children are higher than those of MSSA.The main SCCmec genotype of MRSA in children is SCCmecⅢ.Clinician should use antimicrobial drugs rationally，and furthermore，we should regularlymonitor the change of resistance and preventnosocomial transmission.

children；Staphylococcus aureus；antimicrobial-resistance；staphylococcal cassette chromosome mec；polymerase chain reaction

R 446.5

A

1000-1492（2016）04-0574-05

2015-12-08接收

安徽省自然科學基金（編號：1408085QH157）

安徽醫科大學第一附屬醫院兒科，合肥 230022

夏小榮，女，碩士研究生；
王亞亭，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：wangyating@163.com