酸敏感離子通道在過敏性紫癜腎炎和IgA腎病腎組織中的表達及意義

彭啟迪，袁麗萍，鄧 芳，胡 波，鹿 玲，桂 明

酸敏感離子通道在過敏性紫癜腎炎和IgA腎病腎組織中的表達及意義

彭啟迪，袁麗萍，鄧 芳，胡 波，鹿 玲，桂 明

目的 觀察酸敏感離子通道（ASICs）在過敏性紫癜腎炎（HSPN）、IgA腎病（IgAN）腎組織中的表達及其與腎臟病理損傷的關系。方法 收集HSPN患者13例、IgAN患者11例、正常對照組7例，腎穿刺取腎組織進行蠟塊包埋處理。采用免疫組化法觀察HSPN、IgAN患者腎臟組織中ASIC1、ASIC2、ASIC3的表達情況，采用平均積分光密度（IOD）值分析ASICs在腎組織中的表達情況，同時分析ASICs表達與腎臟病理損傷的關系。結果 ①免疫組化顯示HSPN、IgAN患者腎臟組織中ASIC1、ASIC2、ASIC3主要表達在腎小管，少量表達于腎小球；②HSPN與IgAN組腎臟組織ASIC1、ASIC2、ASIC3表達量較正常對照組明顯增多（P＜0.01），IgAN組較HSPN組ASIC1、ASIC2表達量增多（P＜0.05）；③HSPN組和IgAN組ASICs表達量、24 h尿蛋白定量在病理分級Ⅲ級比Ⅱ級顯著增多（P＜0.01）；④HSPN組

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：02 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.056.htm l中ASIC1表達量與24 h尿蛋白定量呈正相關性（r=0.788，P＜0.05）；IgAN組中ASIC1表達量與24 h尿蛋白定量呈正相關性（r=0.716，P＜0.05）。結論 ASICs在HSPN、IgAN腎組織均有表達，尤其是腎小管，其表達量與病理損傷和尿蛋白有一定關系，推測其可能參與了HSPN、IgAN腎臟病理損傷過程。

過敏性紫癜腎炎；IgA腎病；酸敏感離子通道；腎組織

酸敏感離子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）是一類由胞外酸化所激活的陽離子通道，屬于上皮鈉通道/退行素（Deg/EnaC）超家族，在神經系統、骨、心血管、膀胱中廣泛表達。迄今已發現由4個不同基因編碼的6個亞基即ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4，亞基之間可形成同聚體或異聚體并表現出不同的通道特性、電流表型、離子選擇性［1-2］。研究［3］證實炎癥刺激可促進多種ASICsmRNA的表達。過敏性紫癜（Henoch-Schnlein purpura，HSP）是由IgA介導的小血管炎，HSP引起的腎損害，稱為紫癜性腎炎（Henoch-Sch?nlein purpura nephritis，HSPN），是常見的繼發性腎臟病，為免疫復合物的沉積和補體活化引起腎小球和間質的一系列炎癥反應。IgA腎病（IgA nephropathy，IgAN）是最常見的原發性腎小球疾病，主要是腎小球系膜區IgA或IgA為主的免疫復合物沉積。IgAN存在炎癥因子增加，且能進一步加重其腎臟損傷的程度［4］。HSP皮膚血管內皮細胞存在ASIC1a和ASIC3的表達［5］，但是ASICs在腎臟組織中的表達的報道甚少。該研究擬用免疫組化法觀察ASICs在HSPN、IgAN腎臟組織中的表達，初步探討ASICs是否參與了HSPN、IgAN腎臟損傷的病理過程。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選取安徽醫科大學第一附屬醫院2014年1月～12月住院的HSPN患者13例（HSPN組），其中男5例，女8例；年齡8～29（20.08± 6.96）歲；IgAN患者11例（IgAN組），其中男4例，女7例；年齡10～31（25.27±3.58）歲；正常對照組7例（我院病理科正常腎組織標本），其中男5例，女2例；年齡8～28（21.57±7.98）歲，各組間年齡、性別構成差異無統計學意義。用2%利多卡因進行分層浸潤麻醉，腎穿針在B超引導下進針達腎表面，連接穿刺槍獲取1 cm長腎組織小柱。腎穿組織進行蠟塊包埋處理。

1.2 試劑與儀器 兔抗ASIC1、ASIC2、ASIC3多克隆抗體（英國abcam公司）；免疫組化試劑盒和DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測腎臟組織中ASICs表達

按免疫組化試劑盒操作說明檢測HSPN、IgAN患者腎臟組織中ASIC1、ASIC2、ASIC3的表達。用已知陽性反應片做陽性對照，設PBS替代一抗做陰性對照。以腎小管上皮細胞胞質和胞膜呈棕黃色為陽性細胞，每張切片隨機觀察5個400倍物鏡視野。應用Image-Pro Plus圖像分析軟件系統（美國Media Cybernetics公司）對免疫組化結果進行圖像分析。400倍視野下每張切片隨機選取5個視野（每個視野包含1個腎小球）。應用Image-Pro Plus圖像分析軟件測定每個視野中腎小球及腎小管間質區ASICs積分光密度（integral optical density，IOD）值，計算其平均值，即該患兒腎組織ASICs表達水平。

1.3.2 臨床及病理分級標準 HSPN組臨床分型參考國內2009年試行指南［6］：①孤立性血尿型；②孤立性蛋白尿型；③血尿和蛋白尿型；④急性腎炎型；⑤腎病綜合征型；⑥急進性腎炎型；⑦慢性腎炎型；HSPN組ISKDC病理分級按中華醫學會兒科學分會腎臟病學組修訂的國際兒童腎臟病研究中心（ISKDC）分類標準［6］；IgAN組病理診斷和分型標準主要參照Lee分級［7］。臨床分型分為腎炎綜合征、腎病綜合征、單純血尿（包括鏡下血尿和肉眼血尿）和腎功能不全（≥CKD 3期）。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，計量資料采用±s表示。不同病理級別組間ASICs表達量、24 h尿蛋白定量比較采用t檢驗，各組間年齡、ASICs表達量采用方差分析，各組間性別構成比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 各組性別、年齡構成比較情況 各組間年齡、性別構成差異無統計學意義（F=1.805，χ2= 2.530）。

2.2 各組腎臟組織ASICs表達情況 HSPN組腎臟組織中可以看到ASIC1、ASIC2、ASIC3在腎小管上皮細胞胞質和胞膜及腎小球表現為染成棕褐色的顆粒，染色強度明顯加深，陽性腎小管數明顯增多。IgAN組腎臟組織中可以看到ASIC1、ASIC2、ASIC3在腎小管上皮細胞胞質和胞膜及腎小球表現為染成棕褐色的顆粒，染色強度顯著加深，陽性腎小管數顯著增多。正常對照組腎臟組織中可以看到ASIC1、ASIC2、ASIC3在腎小管細胞胞質和胞膜表現為染成淺棕色或者黃色的顆粒，染色強度較HSPN及IgAN組淺，陽性腎小管數也較之少。見圖1。HSPN、IgAN組中ASIC1、ASIC2、ASIC3表達量均較正常對照組明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01），IgAN組較HSPN組ASIC1、ASIC2表達量也增多，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 HSPN和IgAN組的臨床及病理分型 HSPN

組臨床分型主要為血尿和蛋白尿型13例，急性腎炎型5例及慢性腎炎型8例；病理分型主要為ISKDCⅡ和Ⅲ級，其中ISKDCⅡ級 7例，Ⅲ級6例。IgAN組臨床分型主要為腎炎綜合征8例，腎病綜合征1例，腎功能不全2例；病理類型為LeeⅡ和Ⅲ級，其中LeeⅡ級2例，Ⅲ級9例。

2.4 ASICs表達量、24 h尿蛋白定量在不同病理類型的區別

2.4.1 ASICs表達與病理的關系 HSPN組ASIC1表達量、24 h尿蛋白定量在ISKDCⅢ級比ISKDCⅡ級顯著增多，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。IgAN組ASIC1、ASIC2、ASIC3表達量、24 h尿蛋白定量在LeeⅢ級較LeeⅡ級顯著增多，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。

2.4.2 ASICs表達量與24 h尿蛋白定量的關系HSPN組中ASIC1表達量與24 h尿蛋白定量呈正相關性（r=0.788，P＜0.05），IgAN組中ASIC1表達量與24 h尿蛋白定量呈正相關性（r=0.716，P＜0.05），見圖2。

表1 腎組織中　ASICs表達定量分析（±s）

表1 腎組織中　ASICs表達定量分析（±s）

與正常對照組比較：**P＜0.01；與　HSPN組比較：#P＜0.05

項目　正常對照組（n=7）　HSPN組（n=13）　IgAN組（n=11）　F值　P值ASIC1　17.171±7.047　82.804±37.724**　123.390±45.045**#17.942　0.000 ASIC2　29.032±15.532　66.345±35.582**　131.210±49.405**#　16.861　0.000 ASIC3　19.307±11.038　100.810±58.558**　124.660±53.661**9.845　0.001

表2 不同病理類型的腎組織　ASICs表達量、24 h尿蛋白定量分析（±s）

表2 不同病理類型的腎組織　ASICs表達量、24 h尿蛋白定量分析（±s）

與ISKDCⅡ級比較：**P＜0.01；與　LeeⅡ級比較：##P＜0.01

項目　n IOD值ASIC1　ASIC2　ASIC3 24 h尿蛋白定量（g）HSPN ISKDCⅡ級　7　57.223±22.909　57.571±26.364　93.311±60.013　0.590±0.228 ISKDCⅢ級　6　112.640±28.297**　76.581±44.396　109.560±61.132　1.848±0.260**IgAN LeeⅡ級　2　47.788±28.200　58.709±24.672　36.700±25.718　0.410±0.339 LeeⅢ級　9　140.190±26.273##　147.330±36.993##　144.210±33.943##　1.734±0.398##

圖1 腎組織ASIC1、ASIC2、ASIC3的表達 免疫組化×400A：HSPN組；B：IgAN組；C：正常對照組；1：ASIC1；2：ASIC2；3：ASIC3

3 討論

HSPN是HSP的主要表現之一，是兒科最常見的繼發性腎小球疾病之一，兒童較成人自限性及預后較好，但仍可能呈現慢性進展，最終發展為終末期腎臟病而要接受腎臟替代治療。

圖2 ASIC1與24 h尿蛋白定量的關系A：HSPN組；B：IgAN組

IgAN是一種常見的腎小球疾病，在我國其發病率約占原發腎小球腎炎的25%～33%，也是引起終末期腎臟功能衰竭最常見原因之一。研究［8］表明，其是一組進展性疾病，約有15%～40%患者發展為終末期腎臟病而不得不接受腎臟替代治療。

IgA在腎小球系膜區的沉積引起系膜細胞增生及上皮細胞新月體形成是兩者共同的病理變化特點，兩者臨床表現多種多樣，研究［9］報道IgAN可以進展為HSPN，甚至認為兩者是同一種疾病的不同臨床表現，但是兩者在臨床表現、病理類型等方面仍有差別［10］，研究［11］表明HSPN是急性病理過程及預后與腎小球損害程度有關，而 IgAN是慢性進展性腎小球疾病，兩者均伴有不同程度的腎小管病變，但以IgAN更多見、更嚴重，且是腎臟損傷潛在的機制，尚未完全闡明。

ASICs表達于多種器官及組織，其在腦缺血、腫瘤等伴有局部組織酸化的病理過程中發揮重要作用。炎癥常伴有組織酸化，HSP皮膚血管內皮細胞存在ASIC1a和ASIC3表達，其可能參與了皮膚血管損傷的過程［5］。腎臟組織是對酸堿度變化非常敏感的器官并且能夠通過一系列機制來感受和精準地調節機體酸堿度來維持系統和局部組織的酸堿平衡，HSPN、IgAN腎臟組織都發生了炎癥改變，IgA的沉積加重了炎癥細胞浸潤，炎癥介質分泌量增加，局部組織pH值下降，Brown etal［12］認為ASICs可能是腎小管感受pH變化的感受器之一，另外Tilmann et al［13］認為腎臟肽能傳入神經元與腎炎的腎臟損傷有關，而神經元上的ASICs感受胞外pH下降進而將信號傳入神經元后引起腎臟的損傷。眾多學者研究［14］已經證實蛋白尿水平是評估腎臟損傷嚴重程度及預后的重要指標，病理類型與病情嚴重程度存在一定相關性，本文也證實病理類型級別高的蛋白尿定量水平高于病理類型級別較低者。本研究顯示ASIC1、ASIC2、ASIC3在HSPN、IgAN腎臟組織中均有表達，以腎小管為主，少量表達于腎小球，較正常腎組織表達量顯著增多，并且病理類型越重，ASICs表達量越多；IgAN組比HSPN組ASIC1和ASIC2表達量多，差異有統計學意義，由此筆者推斷ASICs也可能參與了HSPN、IgAN腎臟損傷的過程。

體外研究顯示，腎小球受損濾過的尿蛋白進入腎小管，血漿蛋白里的成分可刺激腎小管上皮細胞產生單核細胞趨化蛋白1、內皮素1和白介素-8等物質，誘導核轉錄因子-κB活化，誘導發生腎間質炎癥反應，促進腎小管間質纖維化，從而影響腎小管功能［15］。本研究顯示ASICs在腎小管表達量較多并且ASIC1的表達量與24 h尿蛋白定量存在相關性，腎間質發生炎癥反應導致局部組織酸化，極有可能通過激活ASICs引起腎小管的損傷。

［1］ Waldmann R，Champigny G，Bassilana F，et al.A proton-gated cation channel involved in acid-sensing［J］.Nature，1997，386 （6621）：173-7.

［2］ Xiong Z G，Pignataro G，Li M，et al.Acid-sensing ion channels （ASICs）as pharmacological targets forneurodegenerative diseases ［J］.Curr Opin Pharmacol，2008，8（1）：25-32.

［3］ Voilley N，deWeille J，Mamet J，et al.Nonsteroid anti-inflammatory drugs inhibit both the activity and the inflammation-induced expression of acid-sensing ionchannels in nociceptors［J］.JNeurosci，2001，21（20）：8026-33.

［4］ Lai K N，Leung JC，Chan L Y，et al.Activation of podocytes by mesangial-derived TNF-alpha：glomerulo-podocytic communication in IgA nephropathy［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2008，294 （4）：F945-55.

［5］ 費文君，袁麗萍，吳 琳，等.酸敏感離子通道在過敏性紫癜血管內皮細胞中的表達［J］.安徽醫科大學學報，2012，47 （2）：189-93.

［6］ 中華醫學會兒科學分會腎臟病學組.兒童常見腎臟疾病診治循證指南（二）：紫癜性腎炎的診治循證指南（試行）［J］.中華兒科雜志，2009，47（12）：911-3.

［7］ Lee SM，Rao VM，Franklin W A，et al.IgA nephropathy：morphologic predictors of progressive renal disease［J］.Hum Pathol，1982，13（4）：314-22.

［8］ Li L S，Liu Z H.Epidemiologic data of renal diseases from a single unit in china：analysis based 13 159 renal biopsies［J］.Kidney Int，2004，66（3）：920-3.

［9］ Araque A，Sánchez R，Alamo C，et al.Evolution of immunoglobulin A nephropathy into Henoch-Sch?lein purpura in an adult patient ［J］.Am JKidney Dis，1995，25（2）：340-2.

［10］Mao S，Xuan X，Sha Y，et al.Clinico-pathological association of Henoch-Schoenlein purpura nephritis and IgA nephropathy in children［J］.Int JClin Exp Pathol，2015，8（3）：2334-42.

［11］Yoshikawa N，Ito H，Yoshiya K，et al.Henoch-Schoenlein nephritis and IgA ne-phropathy in children：a comparison of clinical course ［J］.Clin Nephrol 1987，27（5）：233-7.

［12］Brown D，Wagner C A.Molecularmechanisms of acid-base sensing by the kidney［J］.JAm Soc Nephrol，2012，23（5）：774-80.

［13］Tilmann D，Gisa T，Kristina R，etal.Do distinctpopulations of dorsal root ganglion neurons account for the sensory peptidergic innervation of the kidney［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2009，297 （5）：F1427-34.

［14］涂 娟，陳朝英，曹 力.紫癜性腎炎伴大量蛋白尿患兒臨床病理相關性分析［J］.中華兒科雜志，2015，53（5）：379-82.

［15］劉春蓓，胡偉新.蛋白尿加重腎小管間質損傷的機制［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2007，16（1）：57-63.

①The HSPN and IgAN patients’ASICs were widely expressed in kidney tubules，only few were expressed in glomeruli；②The HSPN and IgAN patients’ASICs expressionsweremore than thatof the control group（P＜0.01），ASIC1 and ASIC2 expressions of IgAN tissue weremore than that of the HSPN group（P＜0.05）；③The relationship between ASICs expression and 24 h urinary protein quantity with pathological gradeⅢwas significantly more than pathological gradeⅡboth in HSPN and IgAN（P＜0.01）；④ASIC1 expression was positively correlated with 24 h urinary protein quantity both in HSPN and IgAN.Conclusion ASICs express in both HSPN and IgAN patients’renal tissues，especially in their renal tubules.The expression is related to pathological grade and urinary protein production，which suggests that ASICs could participate in the pathological process of kidney damage.

Expression and significance of acid-sensing ion channels of renal tissue from Henoch-Sch?nlein purpura nephritis and IgA nephropathy patients

Peng Qidi，Yuan Liping，Deng Fang，et al
（Dept of Pediatrics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To observe the expression of acid-sensing ion channels（ASICs）of renal tissue from Henoch-Sch?nlein purpura nephritis（HSPN）and IgA nephropathy（IgAN）patients and its relationship with pathological damages.Methods The study was based on the paraffin-embedded renal tissues from 13 Henoch-Sch?nlein purpura nephritis patients，11 IgA nephropathy patients and the 7 nomal persons.The expression of ASICs in the tissues from HSPN and IgAN patients was examined by immunohistochemical staining，while the expression of ASICs in the renal tissueswas observed undermicroscope light by integral optical density（IOD）.And then，the relationship was analyzed between ASICs expressions and pathological damages according to the outcome.Resu lts

Henoch-Sch?nlein purpura nephritis；IgA nephropathy；acid-sensing ion channels；renal tissue

2015-12-08接收

國家自然科學基金面上項目（編號：81471617）

安徽醫科大學第一附屬醫院兒科，合肥 230022

彭啟迪，女，碩士研究生；
胡 波，男，主任醫師，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：hubo3218@sohu.com

R 725.9

A

1000-1492（2016）04-0578-05