血漿m icroRNA-182在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

張艷艷，徐愛暉，李永懷，胡華青

血漿m icroRNA-182在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

張艷艷1，徐愛暉1，李永懷1，胡華青2

目的 探討microRNA-182（miR-182）在非小細胞肺癌（NSCLC）患者血漿中的表達及臨床意義。方法 采用實時熒光定量PCR法檢測47例NSCLC患者（NSCLC組）和39例體檢健康者（對照組）血漿中miR-182的水平，同時用電化學發光法檢測其血清癌胚抗原（CEA）及細胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）含量。分析miR-182與NSCLC患者臨床特征的關系。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，評估miR-182的診斷價值。結果 miR-182在NSCLC組血漿的相對表達量為1.610（1.435，1.975），與對照組的1.060（0.730，1.355）比較，顯著升高（P＜0.01）；miR-182表達在胸膜轉移上差異有統計學意義（P＜0.05）；在腫塊大小、病理類型、TNM分期及淋巴結轉移上差異無統計學意義；血漿miR-182為1.365時，靈敏度為89.4%，特異度為79.5%；miR-182聯合CEA 及 CYFRA21-1時，曲線下面積（AUC）為0.995，靈敏度高達93.6%，特異度為97.4%。結論 NSCLC患者血漿miR-182表達明顯上調，聯合CEA及CYFRA21-1可彌補單一檢測的局限性。miR-182有望作為一種新的生物標志物用于NSCLC的輔助診斷。

非小細胞肺癌；血漿microRNA-182；實時熒光定量PCR

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：02 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.058.htm l

肺癌是全世界癌癥相關死亡的主要原因之一，約85%是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），80%～90%患者確診時已屬晚期，5年生存率僅約15%［1］。目前廣泛應用于臨床的腫瘤標志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）敏感度低，細胞角蛋白19片段（cytokeratin 19-fragment，CYFRA21-1）特異性差。研究［2］表明，胸部影像學檢查顯示的肺部結節，約50%是良性的。另外，經皮肺穿刺術及支氣管鏡術均為有創檢查。因此，需要建立新的非侵入的、敏感的、實用的早期篩查方法。microRNA（miR）是一類長約20～25 nt的非編碼RNA，在轉錄后水平調節基因表達。近年來研究［3-4］顯示，miR的異常表達與實體腫瘤的發生發展密切相關。miR-182是miR-183家族的一員，血漿中也存在miR-182，其能耐受內源性核糖核酸酶而保持穩定性。研究［5］顯示miR-182在NSCLC組織中表達增高，但在NSCLC血漿中的表達報道少見。該研究用實時熒光定量PCR法檢測miR-182 在NSCLC患者血漿中的表達情況，研究其與各臨床特征之間的關系，探討血漿miR-182水平對NSCLC的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2014年10月～2015年7月于安徽醫科大學呼吸內科及胸外科住院的初診NSCLC患者47例（NSCLC組），其中男27例，女20例；年齡41～80（63.01±8.09）歲，均經病理學或細胞學檢查確診。其中腺癌25例，鱗癌20例，腺鱗癌2例；根據國際抗癌聯盟（UICC，2009年第 7版）TNM分期Ⅰ期4例，Ⅱ期6例，Ⅲ期12例，Ⅳ期25例。其中胸膜侵及者17例，未侵及胸膜者30例。收集2015年4月～2015年5月本院體檢中心的健康者39例（對照組），男21例，女18例；年齡40～76（58.25±7.45）歲。分別抽取全血4 ml，EDTA-K2抗凝，2 h內常溫，2 624 r/min離心10 min，取上層血漿，4℃、11 836 r/min離心15 min后，置于-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑 miRVana PARISKit（美國Ambion公司）；EzOmicsTM一步法實時熒光定量PCR檢測試劑盒、miR-182特異性莖環逆轉錄引物、上下游引物（百奧邁科生物科技有限公司）。

1.3 血漿m iRNA的提取 取冰凍血漿500μl，按照miRVana PARISKit說明書提取總RNA。RNA溶解于20μl無RNA酶水中。

1.4 實時熒光定量PCR 按照EzOmicsTM一步法實時熒光定量 PCR檢測試劑盒說明書操作。總反應體系為20μl，包括RNA模板50 ng，2×Mastermix 12.5μl，miR-182特異性莖環逆轉錄引物（20 μmol/L）0.5μl，上下游引物（20μmol/L）各0.5μl，DEPC-H2O補充至20μl。循環參數：42℃反轉錄60 min；95℃熱失活變性10 min；95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s，共40個循環。結果用2-ΔΔCt法［6］計算。ΔCt=目標基因Ct-內參基因Ct，ΔΔCt=待測標本ΔCt-對照樣本ΔCt。

1.5 血清CEA及CYFRA21-1 安徽醫科大學第一附屬醫院核醫學科采用電化學發光法檢測血清CEA、CYFRA21-1，使用儀器為羅氏公司E601電化學發光儀，試劑由歐諾公司提供，正常參考值為CEA 0～5.0 ng/m l，CYFRA21-1 0～3.3 ng/ml。

1.6 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析。正態分布資料用±s表示，比較采用t檢驗；偏態分布用中位數和四分位數間距［M（Q1，Q3）］表示，采用Mann-Whitney U檢驗；等級資料采用Spearman相關系數檢驗；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，評估血漿miR-182的診斷效能；Logistic回歸分析miR-182聯合CEA及CYFRA21-1的診斷價值，繪制聯合ROC曲線。

2 結果

2.1 熒光定量PCR法檢測U6 snRNA和m iR-182表達 NSCLC組血漿U6 snRNA的Ct值為（14.76 ±0.33），對照組血漿中 U6 snRNA的Ct值為（14.86±0.58），差異無統計學意義（t=0.97），U6 snRNA在兩組中穩定表達。miR-182在NSCLC患者血漿的相對表達量為［1.610（1.435，1.975）］，與對照組［1.060（0.730，1.355）］比較，差異有統計學意義（U=179，P＜0.01）。見圖1。

圖1 NSCLC組與對照組血漿m iR-182相對表達量與對照組比較：**P＜0.01

2.2 血漿m iR-182與NSCLC患者臨床病理特征之間的關系 Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期 NSCLC患者血漿miR-182水平均顯著高于對照組（U=44、28、107，P＜0.01）；Spearman相關分析顯示血漿miR-182水平與TNM分期差異無統計學意義（rs= 0.055，P=0.713）。箱內線代表中位數，兩端線分別代表下四分位數和上四分位數，上下限分別表示最大值和最小值，見圖2。在侵及胸膜組相對表達量較未侵及胸膜組減低，差異有統計學意義（U= 156.5，P＜0.05）。見圖3。與其他臨床病理參數無關。見表1。

表1 血漿　m iR-182表達水平與47例NSCLC患者臨床病理特征的關系［M（Q1，Q3）］

圖2 對照組與TNM分期各組血漿　m iR-182相對表達量與對照組比較：**P＜0.01

圖3 未侵及胸膜組與侵及胸膜組血漿m iR-182相對表達量與未侵及胸膜組比較：*P＜0.05

2.3 血漿m iR-182在NSCLC中的診斷價值 血漿miR-182為1.365時，靈敏度為89.4%，特異度為79.5%，曲線下面積（area under curve，AUC）為0.902（95%可信區間：0.841～0.964），介于CEA和CYFRA21-1之間；CEA為3.45 ng/ml時，靈敏度為55.3%，特異度為97.4%，AUC為0.825（95%可信區間：0.739～0.911）；CYFRA21-1為2.815 ng/ml時，靈敏度為83%，特異度為87.2%，AUC為0.914。血漿miR-182聯合CEA及CYFRA21-1時，AUC為0.995，靈敏度高達93.6%，特異度為97.4%。見圖4。

圖4 血漿m iR-182、CEA、CYFRA21-1及3者的聯合ROC曲線

3 討論

miR是一類內源性非編碼小RNA，廣泛存在于血液、痰、尿、糞便等臨床標本中。健康者血漿miR來源于血細胞。腫瘤患者血漿miR的來源尚無定論，但一般認為與血細胞無關，可能來源于腫瘤細胞分泌、凋亡及破碎細胞的釋放。血循環中的miR能穩定存在，盡管血液中有大量的RNA酶，具體機制尚不清楚，可能與血液中miR的存在形式有關，如外核體［7］、蛋白質復合體［8］等。血漿miR可反復凍融，且在室溫、4℃環境可保持穩定性。血漿中的miR量雖少，但具有良好的穩定性，故可作為臨床研究指標。

miR-182是miR-183家族成員之一，共同定位于人類7q31-34染色體。該區域也是染色體上的不穩定脆性區域，該區域DNA拷貝數的異常擴增，可能是導致腫瘤發生的重要因素［9］。miR-182有促癌基因活性，在肺癌、宮頸癌、結腸癌、乳腺癌等組織中高表達，而在胃癌中表達降低。對于肺癌中miR-182表達的研究多見于組織學和細胞系，國外對于NSCLC患者血漿中miR-182報道［10-11］很少，國內尚無肺癌血漿miR-182表達的研究，僅有一篇肺癌血清學miR-182的研究［12］。

本研究采用實時熒光定量PCR法，檢測47例NSCLC患者及39例健康者血漿中miR-182的表達水平。結果顯示NSCLC組血漿miR-182水平明顯高于對照組，且Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期的患者血漿miR-182水平均亦明顯高于對照組，但 miR-182的表達與腫瘤TNM分期不相關，這與報道［10-11］一致。Shen et al［11］用實時熒光定量PCR法同時檢測NSCLC組織和血漿中miR-182的表達，進一步Spearman相關分析提示兩者有明顯的相關性（rs≥0.85，P＜0.01）。其他miR分子在非小細胞肺癌血清/血漿中也可異常表達，如miR-126［13］、miR-10b［14］等，其表達水平與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移及疾病預后有一定的相關性。Yang et al［15］發現，肺癌早期Sp1通過上調miR-182的表達，進一步抑制FOXO3表達，促進肺癌細胞的生長；肺癌晚期Sp1和miR-182表達下降，FOXO3表達上調，利于肺癌的轉移。本研究進一步對NSCLC患者的臨床特征分析顯示NSCLC患者血漿miR-182的表達減低與腫瘤胸膜轉移有關，這與研究［15］相符。

目前臨床上常用的非小細胞肺癌標志物有CEA、CYFRA21-1等。CEA敏感性低，但特異性較高，尤其是對腺癌。CYFRA21-1對鱗癌有一定的診斷價值，但特異性欠佳。本研究結果顯示血漿miR-182的ROC的AUC為0.872，敏感性高于CEA及CYFRA21-1，但特異性不高，3者聯合可明顯提高對NSCLC的診斷效能，靈敏度達93.6%，特異度為97.4%。因此，血漿miR-182對NSCLC有一定的診斷價值，聯合CEA及CYFRA21-1可彌補單一檢測的局限性。

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The level ofmiR-182 was 1.610（1.435，1.975）in NSCLC group，which was significantly higher than that in the control group（P＜0.01）.The expression ofmiR-182 showed a significant difference in pleuralmetastasis（P＜0.05），and therewas no significant difference in tumor size，pathological type，TNM staging and lymph nodemetastasis.When plasmamiR-182 was1.365，the sensitivity was89.4%，and the specificity was79.5%.The combination ROC analysis of CEA，CYFRA21-1 andmiR-182 revealed increased AUC value to 0.995 with 93.6%sensitivity and 97.4%specificity.Conclusion The plasma miR-182 level is up-regulated in NSCLC patients，which combined with CEA and CYFRA21-1 can remedy the limitation of the single detection.miR-182may be a potential novel biomarker for the diagnosis of NSCLC.

Expressions of p lasma m icroRNA-182 in non-small cell lung cancer and its clinical significance

Zhang Yanyan，Xu Aihui，Li Yonghuai，et al
（Dept of Respiration，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate microRNA-182（miR-182）expressions in plasma of non-small cell lung cancer（NSCLC）patients and its clinical significance.Methods Real-time quantitative PCR（qRT-PCR）was employed to detectmiR-182 from the plasma of 47 NSCLC patients（NSCLC group）and 39 healthy controls（controlgroup）.Serum carcinoembryonic antigen（CEA）and cytokeratin 19-fragment（CYFRA21-1）were examined by chemiluminescence.The relationship between miR-182 expressions and clinicalpathological features was analyzed and receiver operating characteristic（ROC）curvewas drawn to assess the diagnostic value ofmiR-182.Resu lts

non-small cell lung cancer；plasma microRNA-182；qRT-PCR

R 734.2

A

1000-1492（2016）04-0583-04

2015-12-21接收

國家公益性行業科研專項（編號：201302003）

安徽醫科大學第一附屬醫院1呼吸內科、2體檢中心，合肥230022

張艷艷，女，碩士研究生；徐愛暉，女，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xuaihui0909@163.com