生長抑素類似物TT-232的合成

趙紅玲，李松濤，鄧淑華，尹志峰，王良友

(承德醫學院 河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北 承德 067000)

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生長抑素類似物TT-232的合成

趙紅玲，李松濤，鄧淑華，尹志峰，王良友

(承德醫學院 河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北 承德 067000)

摘要：采用多肽固相合成法，以Rink Amide樹脂為載體、Fmoc保護的氨基酸為原料、DIC/HOBt為縮合體系，按照生長抑素類似物TT-232的氨基酸序列從C端向N端順次偶聯，肽樹脂裂解得到還原型TT-232粗品，環化后再經制備型RP-HPLC純化，得到純度為98%的TT-232。

關鍵詞：生長抑素類似物TT-232；固相合成；Rink Amide樹脂

1實驗

1.1試劑與儀器

Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，成都誠諾新技術有限公司；RinkAmide樹脂(替代度0.50mmol·g-1)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、N,N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)，吉爾生化(上海)有限公司；冰乙醚、二氯甲烷(DCM)、三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)、苯甲硫醚、苯甲醚均為分析純；乙腈為色譜純；氨基酸標準品。

圖1　TT-232的結構式1　The structural formula of TT-232

Agilent 1200型反相高效液相-ESI型質譜聯用儀；Newstyle NP7000型反相高效半制備液相色譜儀；LC98-I AAA型氨基酸分析系統；HDFD-3 PSA型制氮機；Christ Alpha 1-4 LD型凍干機；TDL-40B型高速大容量離心機；AR224CN型分析天平；Heal Force Easy20型純水機。

1.2方法

1.2.1還原型TT-232的合成[4]

1.2.1.1Fmoc-Thr-Rink Amide的制備

準確稱取Rink Amide樹脂4.002 g(2 mmol)投入固相合成反應柱中，加入20 mL DMF溶脹30 min，抽干液體；20 mL DMF洗滌一次。分別加入20 mL脫保護試劑DBLK(20%哌啶的DMF溶液)，時間分別是10 min和5 min，茚三酮檢測(Kaiser法)樹脂為紫紅色，證明Fmoc脫除完全，可進行偶聯反應。稱取Fmoc-Thr(tBu)-OH 2.385 g(6 mmol)、DIC 1.114 mL(7.2 mmol)和HOBt 0.972 g(7.2 mmol)，在20 mL DMF中充分溶解后加入到樹脂中，連續鼓入N2，反應2 h后進行茚三酮檢測，樹脂為亮黃色，證明反應充分。抽濾去除反應液。20 mL DMF洗滌，脫保護。

1.2.1.2全保護還原型TT-232肽樹脂的合成

按照TT-232氨基酸序列，重復1.2.1.1氨基酸脫保護與偶聯方法，順次偶聯Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH。肽樹脂合成完畢后，用甲醇收縮樹脂，抽干甲醇，N2吹干樹脂，得到流沙狀肽樹脂6.550 g。

1.2.2裂解與沉淀

向1 g肽樹脂中緩慢加入裂解液(三氟乙酸∶苯甲硫醚∶EDT∶苯甲醚=90∶5∶3∶2，體積比)，室溫裂解2 h，濾除樹脂。將濾液緩慢滴加到60 mL冰乙醚中，邊加邊攪拌，離心10 min；取沉淀加入冷乙醚重復洗滌4次，真空減壓干燥，得到還原型TT-232 粗肽0.344 g。

1.2.3二硫鍵的形成

將還原型TT-232粗肽加入到344 mL超純水中，再緩慢滴加3 mL碘的乙醇溶液(20 mg·mL-1)，溶液變為淡黃色，HPLC監控氧化進程。反應完全后緩慢滴加0.1 mL飽和維生素C水溶液除去過量的碘，反應體系由淡黃色變為無色時停止滴加，經微孔濾膜過濾，得到TT-232粗品溶液。

1.2.4TT-232的分離純化

將TT-232粗品用制備型RP-HPLC分離純化：使用色譜柱ODS-2 反相硅膠柱(20 mm×250 mm，10 μm)；檢測波長215 nm；流動相A為0.3%醋酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫(0～30 min，流動相B：15%～40%)；流速8 mL·min-1；分段收集主峰，35 ℃減壓旋蒸除去乙腈，冷凍干燥得到TT-232純品0.183 g。

1.2.5TT-232分析與結構確證

分別對還原型TT-232粗肽、TT-232粗品和TT-232純品進行HPLC分析，分析條件為：使用Agela C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長215 nm；流動相A為0.1%TFA水溶液，流動相B為0.1%TFA乙腈溶液，梯度洗脫(0～20 min，流動相B：5%～95%)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃。

對TT-232純品進行MS測試及氨基酸組成分析。

樣品處理：準確稱取5 mg TT-232放入10 mL安瓿瓶中，加入5 mL 6 mol·L-1鹽酸溶液混勻，氮氣保護下密封。110 ℃下酸解24 h，將酸解液45 ℃減壓濃縮，加入5 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液，充分溶解。

樣品衍生：取0.2 mL酸解稀釋液加入0.1 mL衍生劑Y(1.2%異硫氰酸苯酯的乙腈溶液)和0.1 mL衍生劑S(13.9%三乙胺的乙腈溶液)混勻，室溫靜置1 h，再加入0.4 mL正己烷充分振蕩，靜置10 min，取下層清液用蒸餾水稀釋5倍，待測。

檢測條件：使用氨基酸分析專用ODS柱，柱溫40 ℃；流速1 mL·min-1；波長254 nm；梯度洗脫見表1。

2結果與討論

2.1HPLC分析(圖2)

由圖2可知，還原型TT-232粗肽保留時間為10.884 min(圖2a)，純度為81.2%；TT-232粗品保留時間為9.827 min(圖2b)，純度為83.9%；TT-232純品保留時間為9.769 min(圖2c)，純度為98.0%。

表1梯度洗脫表

　Tab.1The gradient elution table

圖2　還原型TT-232粗肽(a)、TT-232粗品(b)、 TT-232純品(c)的HPLC圖譜Fig.2　HPLC Spectra of reduced crude peptide TT-232(a), crude TT-232(b) and pure TT-232(c)

2.2TT-232純品的質譜分析(圖3)

由圖3可知，半數離子峰[M+2H]2+=474.4；分子離子峰[M+H]+=947.4，與理論值947.14相符。

2.3TT-232純品的氨基酸組成分析結果[5]

TT-232純品的氨基酸組成分析圖譜見圖4。

圖3　TT-232純品的MS圖譜Fig.3　MS Spectrum of pure TT-232

圖4　標準品(a)與TT-232純品(b)的氨基酸組成分析圖譜Fig.4　Amino acid composition analysis spectra of standard(a) and pure TT-232(b)

2.4討論

Thallion Pharmaceuticals公司研究開發的TT-232是以M2型丙酮酸激酶(PKM2)為靶點的抑制劑[6]，研究表明其對60種人類腫瘤細胞系中的58種有強烈增殖抑制活性，抑制率在50%～95%之間[7]，有望用于多種實體瘤的治療。本研究采用多肽固相合成法獲得TT-232純品，操作簡便。通過不同規模重復實驗(表2)可知，實驗易于放大，重復性好，收率高且穩定，可為進一步藥效學實驗、靶向藥物的設計合成提供原料，為含二硫鍵的多肽類抗腫瘤藥物的規模化制備提供參考。

表2重復實驗

Tab.2　Repeated experiment

3結論

采用多肽固相合成法，以Rink Amide樹脂為載體、Fmoc保護的氨基酸為原料、DIC/HOBt為縮合體系，按照生長抑素類似物TT-232的氨基酸序列從C端向N端順次偶聯，肽樹脂裂解得到還原型TT-232粗品，環化后再經制備型RP-HPLC純化，得到純度為98%的TT-232。

參考文獻：

[1]楊公利,王春暉,唐承薇.新型生長抑素類似物TT-232抗腫瘤的研究進展[J].華西醫藥,2006,21(1):215-216.

[2]KERI G,BALOGH A,HORVATH A,et al.Novel antitumor peptide hormones and their effect on signal transduction[J].J Steroid Biochem Mol Biol,1992,43(1/2/3):105-110.

[3]厲保秋,高繼友,歷凌子,等.多肽藥物研究與開發[M].北京:人民衛生出版社,2011:198-199.

[4]趙紅玲,高楊,李云紅,等.內嗎啡肽-2的合成[J].應用化工,2015,44(6):1154-1156.

[5]王麗莉.多肽類藥物的氨基酸檢測方法[J].科技創新與應用,2014(16):272.

[6]嚴家文,鐘俊,王國成,等.靶向腫瘤糖酵解途徑用于腫瘤治療的研究進展[J].中國新藥雜志,2014,23(5):550-556.

[7]SZOKOLOCZI O,SCHWAB R,PETAK I,et al.TT-232,A novel signal transduction inhibitory compound in the therapy of cancer and inflammatory diseases[J].J Recept Signal Transduct Res,2005,25(4/5/6):217-235.

基金項目：河北省海外高層次人才“百人計劃”資助項目(E201200002)

收稿日期：2016-03-03

作者簡介：趙紅玲(1977-)，女，蒙古族，內蒙古呼倫貝爾人，助理研究員，研究方向：多肽藥物合成，E-mail：zhldxy@163.com；通訊作者：王良友，副研究員，E-mail：liangywang@gmail.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.009

中圖分類號：TQ 464.7

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)07-0040-03

Synthesis of Somatostatin Analogue TT-232

ZHAO Hong-ling,LI Song-tao,DENG Shu-hua,YIN Zhi-feng,WANG Liang-you

(TheKeyLaboratoryofChineseMedicineResearchandDevelopmentofHebeiProvince,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

Abstract：Using a solid-phase polypeptide synthesis method with Rink Amide resin as a solid support，Fmoc-amino acids as raw materials and DIC/HOBt as a condensation system,the crude reduced somatostatin analogue TT-232 was synthesized according to its amine acid sequence from C-terminal to N-terminal by sequential coupling and cleavage of peptide resin.After cyclization,the crude somatostatin analogue TT-232 was purified by RP-HPLC with a final purity of 98%.

Keywords：somatostatin analogue TT-232;solid-phase synthesis;Rink Amide resin

趙紅玲，李松濤，鄧淑華，等.生長抑素類似物TT-232的合成[J].化學與生物工程，2016，33(7)：40-42，47.