子癇前期患者組織因子、組織因子途徑抑制物與血清可溶性血管內皮生長因子受體1的相關性

蔡翼飛,孫麗洲

(1.南京醫科大學附屬常州市婦幼保健院 婦產科,江蘇 常州,213003; 2.南京醫科大學附屬第一醫院 婦產科,江蘇 南京,210036)

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子癇前期患者組織因子、組織因子途徑抑制物與血清可溶性血管內皮生長因子受體1的相關性

蔡翼飛1,孫麗洲2

(1.南京醫科大學附屬常州市婦幼保健院 婦產科,江蘇 常州,213003; 2.南京醫科大學附屬第一醫院 婦產科,江蘇 南京,210036)

摘要:目的探討子癇前期患者外周血組織因子(TF)、組織因子途徑抑制物(TFPI)與及可溶性血管內皮生長因子受體1(sFlt-1)水平的相關性。方法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測健康孕婦、非重度子癇前期孕婦、重度子癇前期孕婦血漿TF、TFPI水平以及血清sFlt-1水平；免疫組化檢測各組胎盤TF抗原的表達。結果3組患者血漿及胎盤TF、血清sFlt-1水平均有顯著差異，且隨病變程度的增加逐漸升高。3組TF/TFPI比值有顯著差異，隨病變程度的增加亦逐漸升高。與非重度PE組相比，重度PE組血清sFlt-1水平顯著升高(P<0.05)。在子癇前期患者中，血漿TF、TF/TFPI比值與血清sFlt-1水平呈正相關。3組中胎盤TF表達與血清sFlt-1水平無相關性。在TF>165.9 pg/mL組中，血漿、胎盤TF、血漿TFPI與血清sFlt-1水平呈正相關。結論子癇前期患者血漿TF、TF/TFPI比值與血清sFlt-1水平存在正相關關系。

關鍵詞:組織因子; 組織因子途徑抑制物; 可溶性血管內皮生長因子受體1; 子癇前期

妊娠期高血壓疾病是指妊娠與血壓升高并存的一組疾病，是產科特有疾病之一，發病率為5～12%[1]。研究[2]表明組織因子(TF)及組織因子途徑抑制物(TFPI)的變化引起的凝血功能異常與子癇前期(PE)的發病有關。可溶性血管內皮細胞生長因子受體-1(sFlt-1)濃度改變引起內皮細胞機能障礙可能也是子癇前期發病原因之一[3]。動物實驗[4]發現抑制TF表達可使sFlt-1及活性氧的釋放減少，從而逆轉胎盤血管生成障礙，恢復胎盤血流，阻斷氧化應激。本研究觀察正常妊娠與子癇前期孕婦外周血中TF、TFPI、sFlt-1以及胎盤中TF的表達水平，現報告如下。

1材料與方法

1.1一般資料

選取2013年10月—2016年3月在常州市婦幼保健院住院剖宮產終止妊娠者84例，包括正常健康孕婦28例，子癇前期孕婦56例(其中重度28例，非重度28例)。3組年齡、體質量、采血時孕周、孕次無顯著差異(P>0.05),見表1。子癇前期的診斷及分類標準參照中華醫學會婦產科學分會妊娠期高血壓疾病學組《妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)》。排除標準:慢性高血壓、糖尿病及心、肝、腎、甲狀腺、血液系統，自身免疫等疾病的患者，以及使用纖溶藥物、肝素的婦女。

1.2方法

1.2.1標本采集、處理和保存:每位孕婦均在入院時抽取靜脈血2管各3 mL。一管用以檢測TF及TFPI，另一管用以檢測sFlt-1。具體方法:TF標本采用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，比例為9∶1。黃疸、脂血的標本放棄，重度溶血的標本重新采血。3 000 r/min×30 min離心分離血漿，置于-80 ℃凍存。sFlt-1標本:靜脈血樣本待自凝，3 500 r/min×5 min離心分離血清，置-80 ℃凍存。剖宮產胎盤娩出后，立即剪取近臍帶附著處無鈣化部位約1 cm×1 cm×1 cm胎盤組織，用滅菌生理鹽水沖凈后置入4%中性多聚甲醛固定，常規脫水處理后，石蠟包埋并制成3 μm厚的連續切片。

表1　3組患者一般資料比較

與健康孕婦比較,**P<0.01。

1.2.2血漿 TF、TFPI及血清sFlt-1檢測:檢測方法均采用ELISA法測定，定量檢測采用F.A.M.E型酶標儀(德國Hamilton Bonadua公司)。TF、TFPI試劑盒由上海晨易生物科技有限公司提供，最低可測范圍為1.0 pg/mL,批內和批間變異系數分別為5.4%和7.6%。sFlt-1試劑盒由上海恒遠生物科技有限公司提供，最低可測范圍為100 ng/L,批內和批間變異系數分別為4.6%和6.8%。

1.2.3免疫組化法測定:經HE染色判斷切片質量后，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(sP)法，在同一時間、同一條件下進行免疫組化檢測。兔抗人TF多克隆抗體為上海鼎冀生物科技有限公司產品。染色步驟按SP試劑盒說明書進行，水煮法修復抗原，一抗滴度為1∶50,PBS(磷酸緩沖鹽溶液)代替一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察切片中滋養細胞免疫染色情況，TF染色陽性反應為細胞有棕黃色顆粒沉著。根據細胞內染色強度進行分級:0級為細胞內無染色或染色不清或呈均勻一致淡黃色，與背景一致；1級為膜或漿內可見少量淡黃色顆粒，明顯高于背景；2級為膜或漿內可見較多深棕色顆粒；3級為膜或漿內可見大量深棕色或褐色顆粒。同時，根據染色陽性細胞百分率進行分級:0級為無陽性細胞；l級為陽性細胞百分率<25%；2級為陽性細胞百分率在25～50%；3級為陽性細胞百分率>50%。以上兩項分級數相加:得分0～1分為“-”，2分為“+”，3～4分為“2+”，5～6分為“3+”。

1.3統計學分析

使用Empower Stats(基于R軟件)進行統計學分析，根據數據分布類型用均數±標準差或中位數(四分位數Q1-Q3)描述；兩組間比較根據數據分布類型采用t檢驗或Kruskal Wallis秩和檢驗，多組間比較采用方差分析或Kruskal Wallis秩和檢驗。指標間相關性分析采用Spearman相關性分析；P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1外周血指標比較

健康孕婦、非重度子癇前期、重度子癇前期患者血漿TF(P=0.002)、血清sFlt-1(P<0.001)水平有顯著差異，且隨病變程度的增加而逐漸升高。血漿TFPI水平在3組間無顯著差異，但3組TF/TFPI比值有顯著差異(P=0.002)。非重度子癇前期組的血漿TF/TFPI比值、血清sFlt-1水平均顯著高于健康孕婦組。重度子癇前期組的血漿TF水平、TF/TFPI比值以及血清sFlt-1水平均顯著高于健康孕婦組。重度子癇前期組血清sFlt-1水平顯著高于非重度子癇前期組(P<0.05)。胎盤免疫組化結果見圖1，子癇前期胎盤組織中TF定位與健康晚孕組相同，主要分布于胎盤合體滋養細胞胞膜，陽性染色均呈棕色、褐色。根據細胞內染色強度以及染色陽性細胞百分率分別進行分級并相加后評分,3組胎盤TF表達水平有顯著差異(P<0.001),且隨病變程度的增加逐漸升高。非重度、重度子癇前期組胎盤TF表達均顯著高于健康組。見表2。

表2　3組孕婦外周血TF、TFPI、sFlt-1含量及胎盤TF免疫組化評分比較

與健康孕婦組比較,**P<0.01; 與非重度PE組比較,#P<0.05。

A.健康孕婦;B.子癇前期(非重度);C.重度子癇前期圖1 在各組中滋養葉細胞TF表達情況 (IHC×400倍,SP法)

2.2外周血血漿TF、TFPI水平、TF/TFPI比值及胎盤TF水平與血清sFlt-1水平的關系

在健康孕婦組中，血漿TF、TFPI水平、TF/TFPI比值及胎盤TF水平與血清sFlt-1水平均無相關性。在非重度子癇前期組中，血漿TF、TF/TFPI比值與血清sFlt-1水平呈正相關。在重度子癇前期組，血漿TF、TFPI、TF/TFPI比值與血清sFlt-1水平呈正相關，其相關性依次遞減。見表3。

以28例健康孕婦組TF水平為基礎，計算TF的95%參考值范圍(88～165.90 pg/mL)后，將子癇前期孕婦(n=56)分為2組(TF≤165.90 pg/mL組29例,TF>165.90 pg/mL組27例)，進一步分析各指標與血清sFlt-1水平的關系。在TF>165.90 pg/mL組中，血漿、胎盤TF評分、血 漿TFPI分別與血清sFlt-1水平呈正相關。TF≤165.90 pg/mL組中,4種指標與血清sFlt-1水平無顯著相關性。見表4。

表3　外周血血漿TF、TFPI、TF/TFPI比值及胎盤TF水平與血清sFlt-1水平的相關性

表4　TF≤165.90 pg/mL組與TF>165.90 pg/mL組外周血TF、TFPI、TF/TFPI比值及胎盤TF表達與血清sFlt-1水平的相關性

3討論

子癇前期發病機制目前尚未明確。“兩階段學說”[1]提示，滋養細胞血管入侵子宮內膜不充分，導致胎盤缺氧。胎盤組織形成多數微血栓，向母體血管釋放合體滋養細胞碎片和血管介質。胎盤缺氧誘發的循環因子的釋放屬于系統性炎癥反應的一部分，后者導致血管反應性的改變，并引起內皮細胞損傷。廣泛的內皮功能異常引起子癇前期的臨床癥狀，其中包括凝血病、各種因微血管血栓引起的器官損傷。TF及其所屬的凝血系統參與上述過程，并與炎癥[5]、內皮損傷[6-7]等其他因素互相作用，最終導致臨床癥狀的出現。研究[2]顯示，子癇前期婦女中，高凝狀態變化往往在臨床癥狀出現前已經存在。因此，研究TF與子癇前期的發病關系，首先是研究其凝血功能。

TF的經典作用是激活凝血級聯。在現代凝血過程概念中，體內凝血過程幾乎都是由外在途徑啟動(TF/FⅦa復合物)。作為TF-FⅦa復合物的唯一生理抑制劑，通常將TFPI與TF一起進行研究。關于子癇前期血漿TF及其主要抑制劑TFPI的作用的研究結果并不一致。根據不同的研究，子癇前期血漿TF水平的升高[8]或者不變[9-10]均有報道。這些互相沖突的數據可能因為研究設計和方法不同，但也可能與診斷標準[11]或者種族差異性[11]有關。本研究中發現，健康孕婦、非重度子癇前期、重度子癇前期患者血漿TF水平有顯著差異，且隨病變程度的增加逐漸升高。2組子癇前期患者TF水平均顯著高于健康孕婦。血漿TFPI在3組間無顯著差異，但是3組間TF/TFPI有顯著差異，隨程度的增加亦逐漸升高。由于TFPI和TF相互作用可以調節人體內的血栓形成，故而與單一指標相比，TF/TFPI比值更能反映二者對于凝血功能的影響效果。本研究結果也提示，隨子癇前期嚴重程度的遞增，高凝狀態亦不斷增強。

近來的研究[12]證實，子癇前期患者，特別是重度子癇前期，胎盤中TF的濃度和mRNA的表達較正常妊娠婦女均升高。與之相反，子癇前期患者胎盤中總TFPI濃度和mRNA的表達低于正常妊娠婦女。這也提示孕婦體內TF/TFPI的失衡狀態可能是造成子癇前期發生的原因。本研究觀察到胎盤中TF的表達在3組間有顯著差異，隨病變程度的增加亦逐漸升高。這也與血漿中TF的水平變化相一致。本研究通過ELISA方法檢測的血漿TF是指循環中微顆粒( MP) 上的TF。MP是一類膜性小囊泡，經過細胞表面的各種化學或物理刺激，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸( PS)外翻，微顆粒脫落。主要來源于血小板、內皮細胞、單核細胞、血管平滑肌細胞和肝細胞[13-15]以及妊娠合體滋養細胞(合體滋養細胞微絨毛膜STBM)。血漿與胎盤TF的水平變化呈一致性表現，提示子癇前期患者血漿中的TF可能主要來源于胎盤。

Flt-1(又名VEGFR-1)即血管內皮生長因子受體-1,對血管內皮生長因子(VEGF-A)有高度親和性，后者對于胎盤血管發育、增生，內皮細胞的存活，血管通透性以及內皮窗孔等至關重要。sFlt-1是FLt-1的變體。缺氧時,FLt-1基因選擇性剪接后形成sFlt-1的mRNA,合成sFlt-1并分泌進入母體血液循環，與VEGF及PLGF連接，降低其生物學作用，進而引起高血壓、蛋白尿等子癇前期經典癥狀。同樣，在人類子癇前期的發病機制中，sFlt-1作為血管內皮缺氧的結果，也作為消耗VEGF及PLGF導致子癇前期臨床表現的原因。作為可以預測子癇前期的指標,sFlt-1升高者，子癇前期的發病率升高5～6倍[16-17]。本研究證實血清sFlt-1水平在3組間有顯著差異，其水平隨子癇前期嚴重程度的遞增逐漸升高。

有研究[18-19]顯示，子癇前期孕婦血清及臍血中C5a升高。盡管免疫失調以及補體激活(C5a)的觸發因素尚不明確，但是TF在該模型中對于胎盤及胎兒損傷是必要的。子癇前期與復發性流產及FGR在發病機制上有相似之處，例如都存在內皮損傷，血栓癥-炎癥-血栓癥惡性循環，血漿和(或)胎盤TF、sFlt-1升高等。實驗提示sFlt-1能誘導滋養細胞上TF的表達，但應用TF單抗所產生的減少sFlt-1并出現最終的逆轉效果提示，TF與sFlt-1表達之間的影響關系至少是雙向的，TF可能位于sFlt-1蛋白表達信號傳遞通路的上游。本研究中發現，在人類子癇前期患者中，外周血中TF與sFlt-1水平存在正相關，這在重度與非重度患者中均得到證實。而基于TF參考值范圍將子癇前期患者分組后，在TF高于參考值上限組中得到了進一步證實，并且胎盤與血漿中的TF均與血清sFlt-1水平存在正相關。這可能與TF的非凝血功能有關。作為一種跨膜糖蛋白，TF的細胞內區域具有信號轉導功能(與FⅦa結合后)，引起一系列非凝血細胞生物過程，例如合成細胞因子、黏附分子和生長因子[20-21]。但調控sFlt-1表達的機制尚不清楚。

本研究結果顯示，在重度與非重度組中,TF/TFPI比值與血清sFlt-1水平變化呈正相關；在重新分組后,TF高于參考值上限組中，血漿TFPI與血清sFlt-1水平變化呈正相關。這也意味TF凝血與非凝血功能在子癇前期發病中同時發揮作用。

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收稿日期:2016-04-17

中圖分類號:R 714.24

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)15-071-05

DOI:10.7619/jcmp.201615020

Correlation between tissue factor，tissue factor pathway inhibitor and sFlt-1 in patients with preeclampsia

CAI Yifei1,SUN Lizhou2

(1.Department of Gynecology and Obstetrics,Changzhou Maternal and Child Health Care Hospital,Changzhou,Jiangsu,213003; 2.Department of Gynecology and Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing,Jiangsu,210036)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the correlation between tissue factor(TF),tissue factor pathway inhibitor(TFPI)and soluble fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt-1) in the patients with preeclampsia.MethodsThe plasma levels of TF and TFPI and the serum level of sFlt-1 were detected by ELISA method in normal pregnant women,non-severe preeclampsia pregnant women and severe preeclampsia pregnant women.The expression of placental TF antigen was detected by immuno histochemistry in three groups.ResultsThe plasma and placental TF,serum sFlt-1 levels had significantly differences in the three groups,and increased gradually with the increase of the degree of the lesions.There was a significant difference in TF/TFPI ratio among the three groups,and gradually increased with the increase of the degree of pathological changes.Compared with the non severe PE group,the serum sFlt-1 level was significantly higher in the severe PE group (P<0.05).In preeclampsia patients,plasma TF,TF/TFPI ratio were positively correlated with serum sFlt-1 level.There was no correlation between the expression of TF in placenta and the serum level of sFlt-1 among the three groups.In the group with TF>165.9 pg/mL,plasma,placental TF,plasma TFPI were positively correlated with serum sFlt-1 level.ConclusionThere is a positive correlation between plasma TF,TF/TFPI ratio and serum sFlt-1 level in patients with preeclampsia.

KEYWORDS:tissue factor; tissue factor pathway inhibitor; soluble vascular endothelial growth factor receptor 1; preeclampsia