固定化反硝化菌在低污染水處理中脫氮性能研究

張煥杰，余璐，朱文穎，孔海南，林燕上海交通大學環境科學與工程學院，上海 200240

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固定化反硝化菌在低污染水處理中脫氮性能研究

張煥杰，余璐，朱文穎，孔海南，林燕*
上海交通大學環境科學與工程學院，上海 200240

摘要：在面源低污染水的原位修復領域，人工濕地生物脫氮過程受溫度、pH波動影響以及NO2--N積累抑制反硝化脫氮效果等問題，因此強化系統脫氮性能在實際工程應用中具有重要意義。固定化微生物技術具有環境變化適應能力以及耐毒害能力強等優點。該研究通過分離篩選高效反硝化菌，對其進行DNA序列分析鑒定及其種屬和系統發育地位分析，并以包埋法加以固定，考察固定化反硝化菌在不同溫度、pH、DO和 C/N下的反硝化性能，分析各因素變化對固定化反硝化菌脫氮效果的影響，探究各影響因素對固定化反硝化菌脫氮性能的作用機理，以期為固定化反硝化菌強化人工濕地脫氮性能提供參考。經反硝化能力測定，篩選得到的高效反硝化菌株對NO3--N、TN的去除率分別為98.83%、98.36%，NO2--N積累量僅為0.28 mg·L-1，24 h內脫氮效率為8.59 mg·L-1·h-1，經16S rRNA測序結果表明該菌株與Pseudomonas stutzeri A1501的最大相似度為99.7%。采用PVA、SA為材料包埋固定該菌株，固定化反硝化菌的生物量為15.67 g·L-1，顆粒密度為0.93 g·mL-1。通過對固定化反硝化菌處理低污染水的性能研究得知，pH、T、DO的波動對固定化反硝化菌的脫氮效果影響均小于游離反硝化菌，固定化反硝化菌在pH為7，θ為30 ℃，DO為0.87～1.54 mg·L-1，C/N為5時的脫氮效果最好。

關鍵詞：反硝化菌；固定化；脫氮性能；低污染水

引用格式：張煥杰， 余璐， 朱文穎， 孔海南， 林燕. 固定化反硝化菌在低污染水處理中脫氮性能研究［J］. 生態環境學報， 2016，25（5）: 857-863.

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伴隨工業的發展，我國大部分城鎮飲用水源已受到不同程度的污染，有數據表明，我國七大水系中IV類和V類水體占22.9%，劣V類水體占32.0%（葉少帆等，2010），水源水的污染問題日益嚴重，尋求處理低污染水源的對策和技術變得至關重要。近年來，人工濕地作為一種生態工程手段用于處理達標后排放的尾水或污染較重的溝渠水，對這些低污染水的處理，可有效減輕湖泊流域水體的污染負荷（黃娟等，2009），其對流域面源污染水體的原位修復研究也取得了一定效果（Rai et al.，2013）。

潛流人工濕地內近 90%的有機物和含氮化合物是依靠附著在植物根系和土壤等基質表面的微生物作用去除的，其中微生物的硝化和反硝化作用是人工濕地內氮素去除的主要途徑（Saeed et al.，2012），但人工濕地的脫氮效率受氣溫影響較大，在低于15 ℃的環境下，含氮污染物的去除效果不佳（Sun et al.，2010）；脫氮過程中濕地系統內pH的變化在一定程度上也會影響硝化-反硝化的作用效果（Cheikh et al.，2013）；而且，不少潛流濕地非植物根際區因溶解氧不足，硝化反應進行不徹底，導致NO2--N積累，對反硝化菌產生毒害作用，從而使生物脫氮的整個過程受阻（王小曉等，2014）。因此，削弱溫度、pH等因素波動以及NO2--N積累對反硝化作用的影響可改善人工濕地的脫氮效果。

本研究將分離篩選所得的高效反硝化菌進行DNA序列分析鑒定及其種屬和系統發育地位分析，并以包埋法加以固定，考察固定化反硝化菌在不同溫度、pH、DO和C/N下的反硝化性能，分析各因素變化對固定化反硝化菌脫氮效果的影響，探究固定化反硝化菌脫氮的最佳條件，并為固定化反硝化菌投加至人工濕地以強化脫氮效果時的投加位置和所需碳源量提供參考。

1　材料與方法

1.1 培養基

反硝化培養液：KNO32 g·L-1，酒石酸鉀鈉20 g·L-1，K2HPO40.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1。

固態反硝化培養基：KNO31.5 g·L-1，CH3COONa 2 g·L-1，蛋白胨15 g·L-1，酵母膏3 g·L-1，葡萄糖1 g·L-1，NaCl 6 g·L-1，瓊脂12 g·L-1，pH為7.0～7.2。

1.2 廢水水質

人工模擬低污染水主要污染物為 NO3--N和COD，成分為 KNO3、葡萄糖、K2HPO4、MgSO4·7H2O，具體濃度根據實驗需要進行調節。

1.3 反硝化菌的篩選

1.3.1 反硝化菌的富集

自云南大理鄧北橋濕地采集基質樣品（礫石）50 g置于500 mL錐形瓶中，加入300 mL已滅菌的反硝化培養液，蓋不透氣橡膠塞，置于30 ℃、100 r·min-1搖床恒溫振蕩培養。待觀察到瓶中培養液液面有大量氣泡后，吸取20 mL的菌液進行富集，連續富集5次。將富集后的菌液采用倍比稀釋法稀釋，并涂布至固體培養基，靜置于 30 ℃恒溫培養箱，培養至長出明顯菌落。

1.3.2 反硝化菌的分離純化

待上述固體培養基長出菌落后，用接種環逐個挑取形態各異的菌落至新的固體培養基平板，劃線分離。挑取分離出來的菌株，在平板上劃線純化，至顯微鏡下觀察顯示無雜菌。分離出的菌株接種至斜面培養基保存備用。

1.3.3 反硝化能力測定

將分離得到的反硝化菌（8株，分別記為A、B、C、D、E、F、G、H）以 5%的接種量分別接種于裝有300 mL反硝化培養液的500 mL三角瓶中，置于30 ℃、100 r·min-1搖床恒溫振蕩培養4 d。每隔12 h測定培養液中OD600和NO3--N、NO2--N、TN濃度，以判斷菌株反硝化能力，篩選高效菌株。

1.4 純化菌株鑒定

取菌種接種于反硝化培養液，置于30 ℃、100 r·min-1搖床恒溫振蕩培養24 h，8000 r·min-1離心5 min后的菌體作為樣品，由微基生物（上海）科技有限公司完成菌種的鑒定。具體方法如下，菌種基因組DNA抽提采用CTAB法；16S擴增引物為8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTAYGACTT-3'。 PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s；步驟2循環25次，72 ℃延伸5 min。PCR產物回收采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒；PCR產物克隆使用BioLinker的pED-T載體試劑盒，PCR測序結果在NCBI中進行Blast比對。

1.5 反硝化菌擴培

從固態反硝化培養基上挑取菌株一環放入裝有300 mL反硝化培養液的500 mL三角瓶中，置于30 ℃、100 r·min-1搖床恒溫振蕩培養24 h，然后按5%的接種量在相同條件下培養24 h，8000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，用無菌水重復洗滌3次，制成菌懸液備用。

1.6 反硝化菌株的固定化

稱取8 g PVA和2 g SA于90 mL蒸餾水中，80 ℃水浴加熱并攪拌至均勻糊狀，冷卻至 30 ℃后，加入10 mL菌懸液，攪拌均勻后，用注射器滴入含2% CaCl2的飽和硼酸溶液中硬化24 h，交聯成3～5 mm的固定化顆粒。無菌水沖洗后用于后續實驗，剩余的放于4 ℃無菌生理鹽水中保存。

1.7 固定化反硝化菌性能

1.7.1 固定化反硝化菌投加量的確定

分別稱取固定化反硝化菌顆粒1、5、10、20 g加入裝有100 mL人工模擬低污染水（NO3--N濃度約為5 mg·L-1，C/N為5）的150 mL三角瓶中，置于30 ℃、100 r·min-1搖床振蕩，每12 h取水樣，測定NO3--N、NO2--N、TN濃度。

1.7.2 pH、θ、DO、C/N對固定化反硝化菌脫氮效果的影響

稱取固定化反硝化菌顆粒 10 g分別加入裝有100 mL人工模擬低污染水（根據實驗調整）的150 mL三角瓶中置于30 ℃（θ實驗除外）、100 r·min-1搖床中振蕩，24 h后取水樣（C/N實驗每隔12 h取樣1次），測定NO3--N、NO2--N、TN濃度（表1）。

表1　反硝化性能實驗影響因素設計表Table 1　Experiment design for factors affecting denitrification performance

1.8 測試方法

水質監測：NO3--N、NO2--N、TN的測定分別采用 QC-8500流動注射儀。DO、pH測定采用HQ300D DO測定儀，PHS-3CT pH計。

反硝化菌生長情況（OD600）測定采用UV2600紫外可見分光光度計。

2　結果與分析

2.1 反硝化菌的反硝化能力測定

根據 4 d后 8株反硝化菌在反硝化培養液中NO2--N積累量和NO3--N、TN的去除率以及OD600數據變化趨勢分析可知（如圖1所示），8株反硝化菌都具有較高的NO3--N去除率，但菌株A、E由于NO2--N的積累量較大而使其TN去除率較低，可見NO3--N去除率并不能作為反硝化菌反硝化能力高低的單一指標，綜合分析NO2--N積累量和NO3--N、TN的去除率3個指標，篩選出NO3--N、TN去除率最高（分別為98.83%、98.36%）、NO2--N積累量最低（0.28 mg·L-1）的菌株C作為后續實驗的高效反硝化菌。菌株C在48 h內的脫氮效率為5.56 mg ·L-1·h-1，在96 h內的脫氮效率為2.75 mg ·L-1·h-1。

圖1　8株反硝化菌的反硝化能力及生長情況比較Fig. 1　Comparison of denitrification ability and growth of 8 strains of denitrifying bacteria

2.2 菌種鑒定及分析

對菌株C樣品經基因組DNA抽提，16S PCR擴增，T載體轉化（目的條帶大小為1500 bp）后測序，測序結果在NCBI中進行Blast比對，鑒定結果表明菌株C與Pseudomonas stutzeriA1501（序列號為NR_074829.1）的最大相似度為99.7%。據文獻報道P. stutzeriA1501可以在土壤中存活，為內生菌定殖于植物根部表面，并侵入根皮層的表面層（Rediers et al.，2003），因此該菌在人工濕地植物根區基質中可富集并分離。燕永亮等（2005）通過全基因組“Shotgun”法繪制該菌株的基因組草圖，與其他反硝化菌比對結果表明，P. stutzeriA1501株中的 40個反硝化基因組成了一套完整的反硝化催化系統，且P. stutzeriA1501株中nir基因（亞硝酸鹽還原酶類）有16個，是所有已知反硝化菌中nir基因數量最多的。由亞硝酸鹽轉化為氧化氮的過程是反硝化作用有別于其他硝酸鹽代謝的標志性反應，是反硝化過程中最重要的限速步驟，亞硝酸鹽還原酶（Nir）是催化此反應的限速酶（郭麗蕓等，2011），且從圖1 可看出，P. stutzeriA1501株的NO2--N積累量很少。另外，該菌株不僅具有反硝化功能，還表現出對硝酸鹽的固氮酶活性，并且在自然環境和微好氧條件下具有很好的固氮能力。

圖2　菌株C 16S rRNA系統發育樹Fig. 2　Phylogenetic tree of strain C based on 16S rRNA

由圖 2的系統發育樹分析可知，菌株 C與Pseudomonas stutzeri的進化距離最為接近，確定其為施氏假單胞菌，其所屬的假單胞菌屬是自然界中存在最普遍的反硝化菌之一（方晶晶等，2010）。目前已有多種P. stutzeri的菌株被篩選出來，用于反硝化脫氮的有菌株 T13、RCH2、ZoBell等，也有用于固氮研究的，如菌株 B1SMN1、KOS6、DSM4166等（Yan et al.，2008；Li et al.，2012；Han et al.，2010；Pe?a et al.，2012；Busquets et al.，2012；Grigoryeva et al.，2013；Yu et al.，2011）。圖 2所示進化距離與菌株 C較為接近的是Pseudomonas otitidis，有研究表明，該菌主要用于染料廢水脫色，其對三苯甲烷類染料具有不錯的脫色效果（Wu et al.，2009）。類產堿假單胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligene）也具有一定的反硝化能力，不同的是其含有耐熱堿性脂肪酶基因等。通過對菌株C的系統發育分析，明確了其在所屬菌屬中反硝化作用的能力與地位。

2.3 固定生物量

100 mL均勻糊狀載體與反硝化菌菌懸液的混合物反硝化菌濃度為15.67 g·L-1，固定化反硝化菌顆粒密度為0.93 g·mL-1，1 g固定化顆粒中所含反硝化菌質量平均為0.02 g。與吸附法固定微生物相比，包埋法所固定的微生物量較高。當然，所固定微生物的量因固定材料的不同而有所差異，如Ye et al.（2012）實驗研究中未經固定的活性污泥反應器中的生物量為4 g·L-1，以聚氨酯材料為載體吸附固定的微生物量為12.8 g·L-1；而Rezaee et al.（2008）研究中使用微生物纖維素吸附 P. stutzeri的生物量約為1.0 mg·g-1。

2.4 固定化反硝化菌投加量的確定

綜合分析在不同固定化反硝化菌顆粒投加量下，NO2--N濃度以及TN去除率隨時間的變化如圖3所示。當固定化反硝化菌顆粒投加量分別為1、5、10 g時，隨著固定化反硝化菌顆粒投加量增加，TN去除率增大，但當固定化反硝化菌顆粒投加量增至20 g，反硝化進行12 h后，由于NO2--N的積累，其TN去除率最低。盡管36 h后其TN去除率有所提高，但仍低于投加量10 g下相同時刻的TN去除率，說明該反硝化系統中的限速有可能發生在亞硝酸鹽的轉化中。

2.5 pH、θ、DO、C/N對固定化反硝化菌脫氮效果的影響

從圖4中不同pH下NO3--N濃度變化圖以及TN去除率變化可知，固定化反硝化菌和游離反硝化菌的適宜pH范圍均為7～8。對于游離態反硝化菌，當pH低于7或高于8時，反硝化作用很弱，可見pH變化對其影響很大。當pH為8和6時，固定化反硝化菌的TN去除率明顯高于游離反硝化菌，這說明，固定化作用在一定程度上緩解了 pH變化對反硝化菌的影響（He et al.，2012），其他研究者的結論也從不同角度分析了固定化作用對反硝化性能的改善，如王建龍（2003）通過分析多種有毒抑制物質及不利環境對固定化微生物的影響，認為固定化微生物對環境耐受性優于游離微生物的原因視環境因素的不同而不同，對溫度、pH等環境因素的適應性則主要是由于固定化載體對微生物細胞產生了保護作用，也有研究認為這可能是由于固定化材料對NO3--N的吸收作用造成的（Ma et al.，2015）。

圖3　不同固定化反硝化菌投加量下的TN去除率及NO2--N濃度變化Fig. 3　Changes in total nitrogen removing rate and nitrite concentration under different dosage of immobilized denitrifying bacteria

從圖4可以看出，固定化反硝化菌與游離反硝化菌對TN的去除效果最好的溫度均為30 ℃，不同的是二者抵抗環境溫度變化的能力，當溫度自30 ℃降至10 ℃，從不同溫度下NO3--N濃度變化圖以及TN去除率變化圖中可明顯看出，固定化反硝化菌的脫氮效果雖不如其在 30 ℃時，但優于相同溫度下游離反硝化菌的脫氮效果。雖然在此過程中固定化反硝化菌的 NO2--N濃度稍高于游離反硝化菌，但總體 NO2--N濃度很低，而且，隨著處理時間的增加，NO2--N繼續減少。結合目前人工濕地在低污染水處理的脫氮效率受氣溫影響較大的現狀（Werker et al.，2002），本實驗通過比較固定化與游離反硝化菌在溫度范圍為 10～40 ℃時的反硝化性能，可以看出固定化反硝化菌在人工濕地系統中應用占據一定優勢。

圖4　pH、溫度、DO、C/N對固定化反硝化菌的反硝化性能影響Fig. 4　Effects of Ph， Temperature， DO， C/N on denitrification of immobilized denitrifying bacteria

在DO對固定化反硝化菌影響實驗中，DO設置為5個梯度范圍。由圖4中TN去除率變化分析可見，游離反硝化菌在整個 DO變化范圍內，TN去除率隨DO濃度升高呈減弱趨勢。與此不同的是，固定化反硝菌的TN去除率先升高后降低，DO濃度為0.87～1.54 mg·-L1時固定化反硝化菌的TN去除率最高，為71.21%。結合NO3--N和NO2--N濃度變化圖分析，DO濃度從 0.38～0.82 mg·L-1增至0.87～1.54 mg·L-1的過程中，固定化反硝化菌對NO3--N的利用增加，且NO2--N的積累量減少，可能是由于在一定的DO濃度范圍內，適當提高混合速度有利于固定化顆粒固液界面物質的傳質過程，從而有利于反硝化作用的進行。當 DO濃度從0.87～1.54 mg·L-1增至1.78～2.26 mg·L-1時，TN去除率變化明顯，說明此時的DO變化對固定菌的反硝化作用影響較大。DO濃度在 1.78～2.26 mg·L-1到3.31～4.16 mg·L-1波動范圍內，固定化作用對氧氣擴散的阻礙（Omar，1993）使得多余DO對固定化反硝化菌的影響小于游離反硝化菌，從而使固定化反硝化菌顯示出一定的優勢。研究表明，固定化實驗操作中微生物細胞濃度和PVA、SA凝膠的均勻性會影響固定化顆粒對氧氣的擴散速率（Hulst et al.，1985；Martinsen et al.，1992）。

對于低污染水的脫氮處理常存在碳源不足的問題，通過外加碳源可加強脫氮效果，但外加碳源如果不適量，有可能造成二次污染，而通過固定化方法將反硝化過程控制在投加碳源的反應器內部，使多余碳源重復利用成為可能。由圖4可知，當固定化反硝化菌處理低污染水（初始NO3--N濃度為5 mg·L-1）12 h時，NO3--N濃度隨C/N的增加而減少，NO2--N濃度和TN去除率隨著C/N的增加而增加，其中C/N為1的固定化反硝化菌的TN去除率明顯低于其他幾組。當處理48 h時，C/N為5、7、10 的3組實驗之間的TN去除率相差不到2%，多余碳源的存在反而會增加NO2--N積累量。因此，實驗中固定化反硝化菌所需的最佳C/N為5。在實際人工濕地系統中，可通過固定菌投加位置及方式的設計改進，綜合考慮系統進水水質特點，以及濕地植物根系分泌物中可利用碳源的產生情況，提高系統對碳源的利用率，從而緩解碳源不足的問題。

3　結論

經富集、分離、純化后得到8株反硝化菌，篩選得到NO3--N、TN去除率最高（分別為98.83%、98.36%）、NO2--N積累量最低（0.28 mg·L-1），24 h內脫氮效率為8.59 mg·L-1·h-1的菌株C，經分子生物學鑒定后為Pseudomonas stutzeriA1501（序列號為NR_074829.1）。

固定化反硝化菌的生物量為15.67 g·L-1，固定化反硝化菌顆粒密度為0.93 g·mL-1， 1 g固定化顆粒中所含反硝化菌量平均為0.02 g。對于實驗中人工模擬低污染水（NO3--N濃度約為5 mg·L-1，C/N 為 5），固定化反硝化菌顆粒的最適投加量為 0.1 g·mL-1。pH為 7，θ為 30 ℃，DO質量濃度為0.87～1.54 mg·L-1時的脫氮效果最優。

在模擬低污染水處理實驗研究中，pH、θ、DO的波動對固定化反硝化菌的脫氮效果影響均小于游離反硝化菌。低溫10 ℃時，固定化反硝化菌仍可實現47.35%的總氮去除率。

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DOI：10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.05.019

中圖分類號：X172

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5906（2016）05-0857-07

基金項目：國家水體污染控制與治理科技重大專項（2012ZX07105-003）

作者簡介：張煥杰（1991年生），女，碩士研究生，研究方向為水污染控制及生態修復。E-mail: 963484028@qq.com

*通信作者：林燕（1976年生），博士，副教授。E-mail: linyan2002@sjtu.edu.cn

收稿日期：2016-03-08

Nitrogen Removal Characteristics of Immobilized Denitrifying Bacteria for Treatment of Slightly-polluted Water

ZHANG Huanjie， YU Lu， ZHU Wenying， KONG Hainan， LIN Yan
School of Environmental Science and Engineering， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China

Abstract：Denitrification technology plays an important role in in situ remediation of slightly-polluted water. However， the denitrification performance is affected by temperature， pH and the nitrite accumulation particularly in constructed wetland （CW）. In this work， a novel immobilized microbial technology， with the advantages of high adaptability and strong poison resistance， was developed to improve the nitrogen removal efficiency in CW systems. A dominant species denitrifying bacteria “C” was isolated and identified by DNA sequence and phylogenetic analysis. On this basis， its denitrification performances and mechanisms were investigated at varied temperatures， pH， DO， and C/N to address the optimized conditions for nitrogen removal. The results showed that strain “C”， which had 99.7% maximum sequence similarity with Pseudomonas stutzeri A1501， was the superior bacteria with the removal efficiencies of 98.83% for NO3--N and 98.36% for TN， respectively. The nitrate removal rate was found to be up to 8.59 mg N·L-1·h-1by 24 h while the nitrite accumulation was just 0.28 mg·L-1. Furthermore， the denitrifying bacteria “C” was immobilized with PVA and SA to address its denitrification performance in practice. Given the operating conditions of 15.67 g·L-1biomass and 0.93 g·mL-1density， the influence of pH， T， DO on nitrogen removal for immobilized denitrifying bacteria were less than that for free denitrifying bacteria. Also， the optimized conditions for maximum nitrogen removal were found to be pH=7， θ=30 ℃，DO=0.87～1.54 mg·L-1and for C/N=5. The results may provide a positive reference for the enhanced denitrification technology used in the remediation for constructed wetland.

Key words：denitrifying bacteria； immobilization； constructed wetland； slightly-polluted water