慢病毒介導的RNA干擾下調p16的表達對hUC-MSCs衰老的影響*

韓　康，馬珊珊，朱相展，孟　楠，王欣欣，邢　衢，黃團結，韓　莉，石振慶，楊　波，關方霞1,#

1)鄭州大學生命科學學院干細胞研究室 鄭州 450001　2)鄭州大學第一附屬醫院干細胞研究室 鄭州 450052

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慢病毒介導的RNA干擾下調p16的表達對hUC-MSCs衰老的影響*

韓康1)，馬珊珊1)，朱相展1)，孟楠2)，王欣欣2)，邢衢1)，黃團結1)，韓莉2)，石振慶1)，楊波2)，關方霞1,2)#

1)鄭州大學生命科學學院干細胞研究室 鄭州 4500012)鄭州大學第一附屬醫院干細胞研究室 鄭州 450052

摘要目的：利用慢病毒(LV)介導的RNA干擾下調老齡人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)中p16基因的表達，研究p16表達下調與hUC-MSCs衰老的關系。方法：實驗分為第3代(P3)hUC-MSCs組(P3組)、P15 hUC-MSCs組(P15組)、LV-sip16感染P15 hUC-MSCs組(LV-sip16組)和LV-NC感染P15 hUC-MSCs組(空病毒組)。采用CCK-8法檢測細胞增殖，β-半乳糖苷酶染色計算衰老細胞率，流式細胞術檢測細胞周期及凋亡，qRT-PCR檢測衰老相關基因p16、p21、p53、pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA的表達。結果：LV-sip16感染能促進P15 hUC-MSCs增殖，降低衰老細胞率，促使細胞周期進入S期，抑制hUC-MSCs的早期凋亡(P均<0.05)；同時，LV-sip16組細胞中p16、p21、p53 mRNA表達量較P15組降低，而pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA表達量升高(P均<0.05)。結論：下調P15 hUC-MSCs中p16基因的表達能夠延緩和改善hUC-MSCs的衰老。

細胞衰老是指細胞經歷一定次數的有絲分裂后，永久性地進入生長停滯的狀態[1]。人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)雖然是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞，但是隨著傳代次數的增加，其功能也會逐漸衰退[2]。所以，現有的動物實驗主要采用第3～5代的hUC-MSCs進行移植，而有限的細胞來源和數量極大地限制了hUC-MSCs的使用。p16基因是一個腫瘤抑制基因，同時還是細胞周期的關鍵調控基因[3]，課題組前期研究[4]發現，p16基因過表達可促使293細胞發生衰老。該研究以p16基因為切入點，以慢病毒(LV)為載體，利用RNAi技術[5]下調第15代(P15)hUC-MSCs中p16基因的表達，進而觀察p16基因表達下調對hUC-MSCs衰老的影響，并初步探討其機制，為提高干細胞移植治療臨床疾病的效果奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料DMEM/F12細胞培養基和胎牛血清購自Gemini公司，CCK-8試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒和SA-β-半乳糖苷酶衰老檢測試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司，RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量試劑盒購自大連TaKaRa公司，兔抗人P16抗體、山羊抗兔HRP抗體購自上海生工生物技術有限公司。hUC-MSCs和293細胞為實驗室前期凍存的細胞。

1.2靶向p16基因的siRNA的篩選和LV載體的構建根據Genbank提供的p16 mRNA序列，選用上海吉瑪公司設計合成的2個p16 siRNA序列(表1)。利用LipofectamineTM2000分別將siRNA1、siRNA2和NC瞬時轉染293細胞，同時以未轉染細胞(CON組)和轉染時細胞中只加LipofectamineTM2000(Lip2000組)為對照。轉染結束后收集細胞，提取細胞總蛋白，取60 μg總蛋白，采用Western blot檢測P16蛋白的表達，采用qRT-PCR檢測p16 mRNA的表達。將篩選出的siRNA片段送至上海吉凱基因化學技術有限公司構建LV穩定表達載體，包裝獲得含有p16 siRNA的慢病毒(LV-sip16)和陰性對照病毒(LV-NC)。

表1　p16 siRNA 和NC片段序列

1.3細胞分組和LV感染實驗設4組：P3 hUC-MSCs組(P3組)、P15 hUC-MSCs組(P15組)、LV-NC感染P15 hUC-MSCs組(空病毒組)、LV-sip16感染P15 hUC-MSCs組(LV-sip16組)。經預試驗篩選，在MOI=10(病毒濃度為107數量級)、Enis處理條件下感染效率最高。按照比例擴大原則將hUC-MSCs接種于6孔板中，細胞40%融合狀態時進行病毒感染，取2.5 μL病毒原液(1×108TU/mL)和8.4 μL LV-sip16原液(4×107TU/mL)，分別加到1 mL Enis中混勻，逐滴加到6孔板中，37 ℃培養箱培養8～12 h，然后觀察細胞狀態并更換培養基，感染3～4 d后，觀察熒光表達情況。待融合狀態達90%進行傳代擴大培養。

1.4CCK-8法測細胞增殖細胞分組處理同1.3，將4組細胞以每孔2 000個的數量接種于96孔板中，每組設3個復孔，在37 ℃、體積分數5% CO2條件下培養24 h，選擇第1、2、3、4、5天為節點測4組細胞的吸光度，然后吸除舊的培養基，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃、體積分數5% CO2條件下培養2 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度。實驗重復3次。

1.5PI染色檢測細胞周期細胞分組處理同1.3，將4組生長密度達90%的hUC-MSCs消化離心，加入1 mL PBS重懸離心，重復2次，吸除上清，加入1 mL預冷的體積分數70%的乙醇重懸細胞，固定過夜。第2天離心吸除上清，加入1 mL PBS混勻細胞，離心吸除上清，加入500 μL PI染色液，37 ℃避光溫育30 min，最后使用流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次。

1.6FITC染色檢測細胞凋亡細胞分組處理同1.3，將4組生長密度達90%的hUC-MSCs消化離心，然后加入1 mL PBS重懸離心，重復2次，吸除上清，加入100 μL Binding Buffer重懸細胞，將5 μL PI和5 μL FITC分別加入各組細胞中，室溫避光孵育15 min，然后補加400 μL Binding Buffer，最后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1.7β-半乳糖苷酶染色檢測細胞的衰老細胞分組處理同1.3，采用SA-β-半乳糖苷酶衰老檢測試劑盒檢測細胞的衰老情況。光學顯微鏡下觀察染色結果，藍色細胞為衰老細胞。在100倍鏡下選擇細胞形態較好且相互獨立的視野拍照，計算衰老細胞率。實驗重復3次。

1.8qRT-PCR檢測衰老相關基因的表達細胞分組處理同1.3，按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用qRT-PCR分別檢測p16、p53、p21、pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA的表達。CyclinD1、CDK4引物序列見表2，其他引物序列見姚寧等[6]的報道。實驗重復3次。

表2　CyclinD1、CDK4引物序列

1.9統計學處理采用SPSS 21.0處理數據，采用單因素方差分析比較以上各觀測指標的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1有效p16 siRNA的篩選與CON組、Lip2000組、NC組相比，siRNA1和siRNA2組293細胞p16基因表達均降低，siRNA1處理組表達量降低更明顯，見表3。故用siRNA1構建LV-sip16用于后續實驗。

表3　各組p16基因的表達情況

2.24組hUC-MSCs增殖活力的比較LV-sip16組增殖活力高于P15組，但是又低于P3組，見圖1。

A：P3組；B：LV-sip16組；C：P15組；D：空病毒組。圖1　4組hUC-MSCs增殖活力的比較

2.34組hUC-MSCs細胞周期和凋亡的比較相比P15組，LV-sip16組有更多的細胞進入S期，細胞生長得到促進；而細胞凋亡受抑，見表4。

表4　4組細胞周期和凋亡率的比較　%

2.44組hUC-MSCs中衰老細胞率比較染色結果見圖2。P3組幾乎沒有藍染細胞出現；P3組、P15組、空病毒組和LV-sip16組衰老細胞率分別為(1.10±0.20)%、(12.10±1.35)%、(13.40±0.85)%和(8.20±1.12)%，4組比較，差異有統計學意義(F=8 832.328，P<0.001)；P15組、空病毒組和LV-sip16組衰老細胞率均高于P3組，而LV-sip16組低于P15組。

A、B、C、D:分別為P3組、P15組、空病毒組和LV-sip16組。圖2　β-半乳糖苷酶染色檢測細胞的衰老(×100)

2.54組hUC-MSCs中衰老相關基因表達的比較與P3組相比，P15組和空病毒組p16、p53、p21 mRNA表達量升高，pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA表達量降低；與P15組相比，LV-sip16組p16、p53、p21 mRNA表達量降低，pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA表達量升高。見表5、6。

表5　4組hUC-MSCs中p16、p53、p21和pCNA mRNA的表達

表6　4組hUC-MSCs中sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA的表達

3討論

LV載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎發展起來的載體。與腺病毒載體相比，LV載體具有以下優點：①能使目的基因在細胞中長期、穩定表達。②感染細胞范圍廣泛，能有效感染神經元細胞、肝細胞、干細胞等。③低免疫原性[7]。所以，該研究中作者采用LV介導的RNAi技術研究p16基因表達下調與hUC-MSCs衰老的關系。結果發現，LV-sip16能促進P15 hUC-MSCs增殖，降低衰老細胞率，促進細胞周期進入S期，并且抑制hUC-MSCs的早期凋亡；與姚夢枝[8]在脂肪間充質干細胞中的研究結果相一致。但是，該研究結果也發現LV-sip16只能在一定程度上改善和促進P15 hUC-MSCs的增殖，并不能使其達到P3 hUC-MSCs的增殖活性，說明hUC-MSCs的增殖和衰老可能并不是p16一個因素可以控制的。

細胞衰老由兩條信號通路控制，分別為 p16-CyclinD1/CDK4-Rb途徑和p53-p21-CyclinD1/CDK4-Rb途徑[9-11]。該研究發現LV-sip16組中p16、p21、p53 mRNA表達量降低，而pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA表達量升高，說明兩條信號通路并不是彼此獨立的，p16表達下調可能通過p16-CyclinD1/CDK4-Rb通路調控其他衰老相關基因的表達，一定程度上延緩hUC-MSCs的衰老。下一步實驗可以阿爾茨海默鼠為衰老模型，通過移植LV-sip16感染的P15 hUC-MSCs，觀察LV-sip16對阿爾茨海默鼠的抗衰老作用并分析其機制，從而為干細胞移植治療阿爾茨海默癥提供新的思路。

參考文獻

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[5]周紅建,黃松,王雄偉.RNAi技術研究新進展[J].生物技術通報,2010(12):84

[6]姚寧,馬珊珊,崔淵博,等.單細胞海藻提取物對人臍帶間充質干細胞的抗衰老作用[J].鄭州大學學報(醫學版),2015,50(4):458

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[11]DIMRI GP.What has senescence got to do with cancer?[J].Cancer Cell,2005,7(6):505

(2015-09-19收稿責任編輯徐春燕)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.003

#通信作者，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細胞與再生醫學， E-mail:guanfangxia@126.com

中圖分類號Q291

關鍵詞siRNA；p16；慢病毒；人臍帶間充質干細胞;衰老

Effect of lentivirus-mediated RNAi targeting p16 on aging of hUC-MSCs

HAN Kang1), MA Shanshan1), ZHU Xiangzhan1), MENG Nan2),WANG Xinxin2), XING Qu1), HUANG Tuanjie1),HAN Li2), SHI Zhenqing1), YANG Bo2), GUAN Fangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordssiRNA;p16;lentivirus;human umbilical cord derived mesenchymal stem cell;aging

AbstractAim: To study the effect of lentivirus(LV)-mediated RNAi targeting p16 on the aging of hUC-MSCs.Methods: There were 4 groups,the 3rd generation hUC-MSCs group(P3 group), the 15th generation hUC-MSCs group(P15 group), P15 hUC-MSCs infected by LV-sip16 group(LV-sip16 group) and P15 hUC-MSCs infected by LV-NC group(negative control group). CCK-8 assay was performed to detect cell proliferation, β-galactosidase staining was used to detect aging cells, flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis, and the expressions of p16,p21,p53,pCNA,sirt1,sirt2,CyclinD1 and CDK4 mRNA were detected by qRT-PCR.Results: LV-sip16 infection could successfully promote the proliferation of P15 hUC-MSCs, reduce aging cell rate, induce S phase cells, and inhibit the early cell apoptosis(P<0.05); meanwhile, the mRNA expressions of p16, p21, p53 were decreased, while the mRNA expressions of pCNA, sirt1, sirt2, CyclinD1 and CDK4 were increased(P<0.05).Conclusion: Downregulating the expression of p16 in P15 hUC-MSCs could delay and improve the aging of hUC-MSCs.

*國家自然科學基金資助項目81471306,U1404313；河南省科技創新人才計劃154200510008；河南省高校科技創新團隊支持計劃15IRTSTHN022；河南省產學研合作項目142107000008

*：與CON組、Lip2000組和NC組相比，P<0.05；#：與siRNA2組相比，P<0.05。

*：與P3組相比，P<0.05；#：與P15組相比，P<0.05。

*：與P3組相比，P<0.05；#：與P15組相比，P<0.05。

*：與P3組相比，P<0.05；#：與P15組相比，P<0.05。