大氣細顆粒物不同成分對A549細胞遺傳毒性的影響*

劉雪亞，王　平，李　杰，李　萍，衛軍華，高祎楠，張國俊#

1)鄭州大學第一附屬醫院呼吸內科 鄭州 450052　2)河南省職業病防治研究院毒理室 鄭州 450052　3)鄭州大學化學與分子工程學院 鄭州 450001

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大氣細顆粒物不同成分對A549細胞遺傳毒性的影響*

劉雪亞1)，王平2)，李杰2)，李萍1)，衛軍華3)，高祎楠3)，張國俊1)#

1)鄭州大學第一附屬醫院呼吸內科 鄭州 4500522)河南省職業病防治研究院毒理室 鄭州 4500523)鄭州大學化學與分子工程學院 鄭州 450001

摘要目的：研究大氣細顆粒物(PM2.5)不同成分對人肺腺癌Ⅱ型肺泡上皮細胞(A549)遺傳毒性的影響，探索PM2.5暴露的細胞毒性機制及發病機制, 為開展河南地區PM2.5的健康危害評估提供實驗依據。方法：于鄭州市采集并處理PM2.5非水溶性成分和水溶性成分，分為PM2.5非水溶性和水溶性成分不同濃度(50、100、200、400、800 mg/L)染毒組和對照組，采用CCK-8比色法測量A549細胞在染毒后6、12、24、48和72 h的細胞存活率，微核實驗檢測各個濃度染毒24 h后細胞染色體損傷情況。結果：PM2.5非水溶性和水溶性成分均能抑制A549細胞增殖(P<0.05)。染毒24 h 時800 mg/L的大氣PM2.5非水溶性成分或染毒48 h 時800 mg/L的大氣PM2.5水溶性成分作用下細胞存活率最低。PM2.5非水溶性成分和水溶性成分均能誘導A549細胞染色體損傷，與對照組相比，實驗組微核率明顯升高(P<0.05)，非水溶成分致細胞微核率較高(P<0.05)。結論：PM2.5能抑制A549細胞增殖，導致A549細胞染色體損傷。非水溶成分的影響可能更大。

近年來，隨著大氣環境污染日趨嚴重，暴露在污染環境中已對人類健康構成了極大的威脅，肺作為靶器官首當其害。在各種污染成分中，大氣顆粒物尤其是細顆粒物(PM2.5)，即環境空氣中空氣動力學當量直徑≤2.5 μm的顆粒物，已被公認為危害最大、代表性最強的大氣污染物。大量流行病學研究[1-3]表明PM2.5增加住院率、呼吸系統發病率和病死率。PM2.5由于相對較小的體積和較大的表面積，以及其表面攜帶的多種重金屬和有機毒性物質是致DNA損傷的主要成分[4]。當前對PM2.5毒性機制的研究已成為國內外公共衛生和醫學領域研究的熱點和前沿。許多研究[5-9]證明了PM2.5的DNA損傷作用和染色體損傷作用，但有關大氣PM2.5及其不同組分對A549細胞遺傳毒性的影響尚未見文獻報道。該研究以2013年12月采集的鄭州市大氣PM2.5為實驗樣品，并將其分離的不同組分分別作用于體外培養的A549細胞，探討大氣PM2.5對A549細胞的生物效應以及對遺傳物質損傷的影響，從而評價大氣PM2.5的細胞毒性并探討其對呼吸系統損傷的可能作用機制。

1材料與方法

1.2細胞培養采用單層貼壁培養法，用含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg /L鏈霉素的RPMI-1640完全培養基進行日常培養。培養環境：溫度37 ℃，體積分數5%CO2，pH值維持在7.2～7.4，相對飽和濕度為95%。用于實驗的細胞處于對數生長期，細胞存活率達90%以上。

1.3大氣PM2.5樣品采集該研究所使用的大氣PM2.5由鄭州大學環境科學研究院采集，采樣地點位于鄭州市高新區鄭州大學綜合科研樓四樓樓頂(113°31′ E；34°48′ N)，采樣點水平高度為13 m，采樣口位置距樓頂地面約1.5 m。該采樣點周圍開闊，無高大建筑物阻擋，緊鄰交通要道，周圍存在建筑施工工地及較多工廠，取樣可用于評價鄭州市高新區大氣局部污染現狀。采用TE-6070D大流量顆粒物采樣器(Tisch Environment公司，美國)，顆粒物收集在石英濾膜(2500 QAT-UP 8×10)(美國PALL公司)，采樣時空氣流量為1.13 m3/min，采樣時間為2013年12月，連續采樣15 d，采集樣品14份，每 d連續采樣23.5 h，陰雨、大風等極端天氣不采樣。采樣前每張濾膜編號，放入馬弗爐中450 ℃烘烤1 h，稍冷卻后立即放入干燥缸中，過夜后用電子天平稱重，放入干燥缸中采樣時用。采樣后將濾膜放置在恒溫恒濕超凈室內平衡大于48 h，稱重后將采樣膜裝入鋁箔紙袋內，放在-20 ℃冰箱避光保存。

1.4樣品不同成分提取及溶液配制PM2.5不同成分提取及溶液配制：用圓形銃子將采樣膜截取成直徑為37.2 mm的小膜，稱重后浸入超純水中，0 ℃超聲振蕩30 min×3次，將濾膜上的顆粒物洗脫下來獲得混懸液。用6層無菌紗布過濾震蕩液中的紙漿，13 000 r/min離心20 min，提取上清液，將上清液通過3層0.22 μm濾膜過濾后真空冷凍干燥，取得PM2.5水溶成分干粉；收集底層顆粒物，真空冷凍干燥，取得PM2.5非水溶成分干粉，均保存于-20 ℃冰箱備用。臨用前，稱取一定量的樣品，用無菌PBS溶液配制成一定濃度的儲備液，超聲振蕩30 min混勻，高壓蒸汽滅菌后保存于4 ℃冰箱備用。臨用前超聲振蕩混勻，并用完全培養基配制成不同濃度的染毒液。

1.5細胞毒性實驗取對數生長期細胞，胰蛋白酶消化，血球計數板計數后，將A549細胞懸液稀釋至5×104mL-1，按100 μL/孔將稀釋后的細胞懸液接種于96孔板上，置于37 ℃、體積分數5% CO2和飽和濕度的條件下培養24 h至細胞貼壁。分別加入各濃度的PM2.5水溶性成分和非水溶性成分培養基100 μL，使其終濃度為50、100、200、400和800 mg/L。每組均設5個平行孔，同時設置調零孔(無血清培養基、CCK-8)，對照孔(細胞、最大濃度的藥物溶解介質、無血清培養基、CCK-8)。繼續培養6、12、24、48和72 h。染毒結束后，先棄去原培養液，用無血清培養基洗1遍，隨后每孔加入含CCK-8的新鮮無血清培養基100 μL，孵育1 h終止培養。采用酶聯免疫檢測儀檢測450 nm波長下各組細胞的吸光(A)值，記錄所得數據。細胞存活率=(實驗組A值-調零孔A值)/(對照孔A值-調零孔A值)×100%。

1.6微核試驗A549細胞消化后接種于6孔板，培養至細胞貼壁，每孔分別加入各濃度的PM2.5水溶性成分和非水溶性成分培養基2 mL，參照CCK-8實驗結果，選擇細胞存活率在(55±5)%以上的染毒劑量和時間，每組設定3個平行孔。染毒結束后更換新鮮培養基繼續培養24 h，胰蛋白酶消化收集細胞，1 500 r/min離心5 min，以0.075 mol/L KCl低滲處理，固定、氣干法制片及Giemsa染色。在光學顯微鏡下(×400)，每張片子觀察1 000個胞體完整、已轉化的細胞，并記錄細胞微核數，結果以微核率(‰)表示，每個劑量滴4張玻片。

1.7統計學處理采用SPSS 17.0分析。不同濃度PM2.5作用不同時間后A549細胞存活率的比較采用析因設計的方差分析，不同濃度PM2.5作用后A549細胞微核率的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，相同濃度非水溶和水溶性PM2.5作用后A549細胞微核率的比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1PM2.5不同成分對A549細胞的細胞毒性PM2.5非水溶性成分對A549細胞存活率影響的結果見表1。由表1可知，分別以50、100、200、400、800 mg/L的大氣PM2.5非水溶性成分對A549細胞進行染毒，在相同染毒時間下，細胞存活率隨著染毒濃度的增加呈下降趨勢。由于48 h時細胞出現大量死亡，未進行A值的測量。在相同染毒時間下，0與50 mg/L染毒濃度，細胞存活率差異無統計學意義；當染毒濃度≥100 mg/L，細胞存活率下降。在相同染毒濃度條件下，不同時間的細胞存活率比較差異有統計學意義(P<0.05)。濃度與時間交互作用下，染毒24 h 時800 mg/L的大氣PM2.5非水溶性成分作用下，細胞存活率最低。

PM2.5水溶性成分對A549細胞存活率影響的結果見表2。由表2可知，分別以50、100、200、400、800 mg/L濃度的大氣PM2.5水溶性成分對A549細胞進行染毒，在相同染毒時間下，0與50 mg/L染毒濃度，細胞存活率差異無統計學意義；當染毒濃度≥100 mg/L，細胞存活率差異存在統計學意義。在相同染毒濃度下，不同時間的細胞存活率差異有統計學意義(P<0.05)。濃度與時間交互作用下，染毒48 h 時800 mg/L的大氣PM2.5非水溶性成分作用下，細胞存活率最低。

表1　不同濃度PM2.5非水溶性成分作用不同時間后A549細胞的存活率　%

F組間=639.632,F時間=80.295,F交互=8.168,P均<0.001；*:與對照組比較,P<0.05；#:與其他組比較,P<0.05。

表2　暴露于不同濃度PM2.5水溶性成分作用不同時間A549細胞的存活率結果　%

F組間=186.370,F時間=315.456,F交互=49.974,P均<0.001；*:與對照組比較,P<0.05；#:與其他組比較,P<0.05。

2.2PM2.5對A549細胞染色體的損傷作用結果見圖1。光學顯微鏡下觀察，可見細胞呈圓形，分布均勻、密度適中，胞核和胞質染色清晰，核漿分明、透明度好。對照組細胞出現微核較少(圖1A)；隨著染毒濃度的增加，微核細胞增多(圖1B)。隨著PM2.5濃度的增加時，大氣PM2.5非水溶成分和較高濃度水溶成分(≥200 mg/L)均可使A549細胞微核率顯著增高，對細胞染色體產生損傷，各濃度組間微核率與對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)，其中相同PM2.5濃度非水溶成分細胞微核率大于水溶成分(表3)。

A：正常細胞；B：PM2.5處理后細胞。圖1　A549細胞的微核形態(×400)

表3　不同濃度PM2.5處理后對A549細胞微核率的影響　‰

3討論

PM2.5的來源及其在大氣中存留時間不同，其構成成分、直徑大小和濃度也不同。雖然PM2.5只是地球大氣成分中含量很少的組分，但它對空氣質量和能見度等有重要的影響，已成為當今研究的重點。與較大的大氣顆粒物相比，PM2.5直徑小，表面積大，活性強，易附帶大量空氣中有毒、有害物質(例如，重金屬、微生物等)，且在大氣中的停留時間長、輸送距離遠，還可以隨著人的呼吸進人體內，PM2.5易避開氣管細胞纖毛等的過濾進入下呼吸道，可到達支氣管，直達肺泡，有可能越過人體的血氣屏障，在肺泡里擴散、沉積，長期作用可使局部支氣管的通氣功能下降，細支氣管和肺泡的換氣功能喪失，而人體的生理結構又決定了對PM2.5幾乎沒有任何過濾、阻攔能力，因此導致PM2.5可以隨著人的呼吸進入人體，從而引發心肺功能障礙等有關的疾病，同時這些細顆粒物中所含的有害氣體、重金屬等溶解在血液中，對人體健康的傷害更大。

細胞增殖是生物體生長、發育、繁殖和遺傳的基礎，是檢測細胞毒理學常用的手段和方法，能反映受試物的毒性大小。研究[10]顯示，PM2.5的吸附成分如多環芳烴類有機物和重金屬等對細胞存在明顯的毒性作用，但PM2.5中的非水溶成分和水溶成分對細胞產生毒性作用大小及差異，目前國內外的研究對此很少涉及。該實驗選用A549作為體外培養細胞模型，同時引入大氣PM2.5的非水溶成分和水溶成分，考察其對A549細胞的細胞增殖損傷，結果顯示，染毒24 h及更長時間后大氣PM2.5的非水溶及水溶成分均導致 A549細胞活力下降。

微核試驗是一種檢測環境污染物致細胞染色體損傷最常用且有效的方法之一，在環境物質遺傳毒性檢測方面發揮重要作用[11]。Roubicek等[12]通過體外實驗證明大氣PM10的水溶性提取物和有機溶解提取物能顯著誘導細胞微核的發生。魏愛麗等[9]研究發現沙塵暴PM2.5及其有機提取物引起的遺傳損傷主要與劑量和城市有關，無機提取物處理也存在劑量-效應關系。該研究結果表明，大氣PM2.5非水溶成分和較高濃度水溶成分(≥200 mg/L)均可使A549細胞微核率顯著增高，對細胞染色體產生損傷，各濃度間差異顯著，且存在劑量-效應關系。另外，與水溶成分相比，相同濃度的非水溶成分致細胞微核率明顯較高，可能與顆粒物對細胞的機械損傷和有機毒性相關，這些都可能直接或者間接導致了其對細胞的毒性作用。

綜上所述，大氣PM2.5水溶性成分和非水溶性成分均可引起染色體損傷，降低A549細胞存活率。非水溶性成分細胞毒性可能強于水溶性成分，具體機制需進一步研究。

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(2015-11-13收稿責任編輯李沛寰)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.012

#通信作者，男，1966年10月生，博士，主任醫師，教授，研究方向：呼吸系統疾病基礎與臨床，E-mail：zlgj-001@126.com

中圖分類號R563.9

關鍵詞細顆粒物；A549細胞；增殖；微核試驗

Effects of different fractions of air particulate matter on genotoxicity in A549 cell line

LIU Xueya1),WANG Ping2),LI Jie2),LI Ping1),WEI Junhua3),GAO Yinan3),ZHANG Guojun1)

1)DepartmentofRespirationDiseases,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofToxicology,HenanInstituteofOccupationalDiseasesPreventionandControl,Zhengzhou4500523)CollegeofChemistryandMolecularEngineering，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsparticulate matter;A549 cell;proliferation; micronuclei test

AbstractAim: To explore the effects of different fractions of air particulate matter(PM2.5) on genotoxicity in A549 cell line,to investigate the mechanism of cytotoxic and pathogenesis induced by particulate matter, and to provide experimental basis for the health hazard assessment of PM2.5 in Henan.Methods: Water-insoluble fractions and water-soluble fractions of PM2.5 were collected and processed in Zhengzhou. Then divided into PM2.5 (50,100,200,400,800 mg /L) group(experimental groups) and control group. Finally the CCK-8 colorimetric method was used to measure the cytotoxicity in A549 cells after 6, 12, 24, 48 and 72 h, while micronucli test was adopted to detect the chromosome damage after 24 h.Results: Both water-insoluble fractions and water-soluble fractions of PM2.5 could inhibit the proliferation of A549 cells(P<0.05).And cell viability of A549 cells was the lowest after being treated by 800 mg/L PM2.5 water-insoluble fractions for 24 h,and for 800 mg/L PM2.5 water-soluble fractions treated for 48 h were lowest. Both water-insoluble fractions and water-soluble fractions of PM2.5 could induce chromosome damage of A549 cells. The micronucleus rate of experimental groups was higher than that of control groups(P<0.05). The micronucleus rate in A549 cells treated by water-soluble fractions was lower than that in A549 cells treated by water-insoluble fractions at the same concentration(P<0.05).Conclusion: PM2.5 could inhibit A549 cells proliferation, and result in chromosome damage;the water-insoluble fractions of PM2.5 may have greater effects.

*河南省醫學科技攻關計劃項目201401005

*:與對照組比較,P<0.05；#:與其他組比較,P<0.05。