MEF2A RNA干擾對小鼠主動脈內皮細胞MEF2A表達及細胞間黏附分子-1、血管細胞黏附分子-1表達的影響*

周文平，張　輝，張金盈

1)鄭州大學第三附屬醫院心內科 鄭州 450052　2)鄭州大學第一附屬醫院心內科 鄭州 450052　△男，1967年12月生，博士，副主任醫師，研究方向：冠心病，E-mail:wpzhou1212@126.com

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MEF2A RNA干擾對小鼠主動脈內皮細胞MEF2A表達及細胞間黏附分子-1、血管細胞黏附分子-1表達的影響*

周文平1)△，張輝2)，張金盈2)

1)鄭州大學第三附屬醫院心內科 鄭州 4500522)鄭州大學第一附屬醫院心內科 鄭州 450052△男，1967年12月生，博士，副主任醫師，研究方向：冠心病，E-mail:wpzhou1212@126.com

摘要目的：觀察肌細胞增強因子2A(MEF2A)RNA干擾對小鼠主動脈內皮細胞MEF2A及細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)表達的影響。方法：培養小鼠主動脈內皮細胞，構建MEF2A RNA干擾慢病毒或者陰性對照慢病毒(NC)并轉染小鼠主動脈內皮細胞。實驗設對照組(不加慢病毒)、NC組和MEF2A RNA干擾組3組，應用ELISA和RT-PCR法分別檢測MEF2A及ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA的表達水平。結果：ICAM-1在對照組、NC組和MEF2A RNA干擾組上清液中的表達量分別為(1.133±0.182)、(1.267±0.115)、(2.249±0.185) μg/L；VCAM-1在對照組、NC組和MEF2A RNA干擾組上清液中的表達量分別為(2.382±0.204)、(2.253±0.281)、(5.077±0.198) μg/L。ICAM-1、VCAM-1在上清液中的水平及mRNA表達水平，NC組與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；MEF2A RNA干擾組與對照組和NC組相比均升高(P<0.05)。結論：慢病毒介導的MEF2A RNA干擾可抑制小鼠主動脈內皮細胞MEF2A活性及mRNA的表達，并可促進血管內ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA的表達。

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一組動脈硬化的血管病中常見的、最重要的一種，其癥狀主要決定于血管病變及受累器官的缺血程度。肌細胞增強因子2A(myocyte enhancer factor 2A，MEF2A)是目前研究較多的與AS相關的生物活性物質[1]。MEF2A是由定位在15q26的基因編碼的具有507個氨基酸的蛋白質,肌細胞中MEF2A轉錄因子可與多數肌肉特異性基因調控區富含A/T的序列相結合,調控其靶基因轉錄,從而調節心肌發育，并在血管生長發育過程中起重要作用[2]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)可以高效特異地阻斷特定基因的表達，目前已經廣泛地應用于體內外基因功能的研究。該研究應用體外合成的MEF2A短發夾RNA轉染小鼠主動脈內皮細胞，高效特異性地抑制MEF2A的表達，觀察MEF2A RNAi對MEF2A及細胞因子細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)表達的影響，為預防AS的發生提供理論依據。

1材料與方法

1.1細胞及試劑小鼠主動脈內皮細胞購自江蘇江陰齊氏生物科技有限公司。細胞的培養采用江蘇江陰齊氏生物科技有限公司專利產品小鼠主動脈內皮細胞培養試劑盒，在含體積分數5%CO2的細胞培養箱中37 ℃孵育培養。細胞凍存液配制：體積分數10%DSMO、體積分數50%DMEM培養基(含體積分數15%胎牛血清),混合均勻并過濾后備用。胰蛋白酶溶液：蒸餾水配制，濃度為2.5 g/L，注射濾器過濾除菌。

1.2實驗分組及主要步驟①實驗共分3組，對照組、慢病毒陰性對照組(NC組)及不同靶點的MEF2A RNAi組(靶點A、B、C和D)。②MEF2A RNAi效率測定及體外靶片段篩選：對小鼠主動脈內皮細胞轉染NC病毒或者不同的MEF2A RNAi慢病毒載體來確定沉默效率最高的RNAi靶點。實驗重復8次。③觀察RNAi后各組(對照組、NC組和靶點B RNAi組)ICAM-1、VCAM-1水平及mRNA表達的變化。

1.3小鼠主動脈內皮細胞培養上清液中MEF2A及ICAM-1、VCAM-1水平的測定從-196 ℃液氮罐中取出小鼠主動脈內皮細胞，于37 ℃的無菌水浴槽內迅速融化。在含體積分數5%CO2的細胞培養箱中37 ℃孵育培養。于轉染的前1 d，將生長達融合狀態的小鼠主動脈內皮細胞接種于96孔培養板孵育。實驗結束后，收集小鼠主動脈內皮細胞培養上清液，將上清液移入新的96孔板中，按照MEF2A、ICAM-1、VCAM-1 ELISA檢測試劑盒說明書分別測定MEF2A、ICAM-1及VCAM-1的水平。實驗重復8次。

1.4小鼠主動脈內皮細胞MEF2A及ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達水平的測定采用RT-PCR法。用RNA提取試劑盒提取小鼠主動脈內皮細胞總RNA并逆轉錄為cDNA。MEF2A正義鏈5’-GATAGAGATTCAGTGGAGTTCC-3’，反義鏈5’-TGACAGAGTTAAAGAGGAGTGG-3’，產物長度104 bp；ICAM-1正義鏈5’-ATGGCTCAGCCAGGAGTTA ACG-3’，反義鏈5’-CAGCATTGGGGTCAGAC CTCTC-3’，產物長度182 bp；VCAM-1正義鏈5’-GCAGATGAGTTAACGGCTCAGC-3’，反義鏈5’-ACAGACCTCTCTTGGGGTCAGC-3’，產物長度174 bp；內參β-actin正義鏈5’-GCTATGCTCTCCCT CACGCCAT-3’，反義鏈5’-TCACGCACGATTTC CCTCTCAG-3’，產物長度130 bp。PCR反應體系共20 μL，含Taq DNA聚合酶0.5 U、各引物50 pmol。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30個循環；72 ℃延伸5 min。然后行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像系統上成像分析。實驗重復8次。

1.5統計學處理應用SPSS 15.0進行統計學處理。各組間MEF2A蛋白、mRNA表達水平及上清液中ICAM-1、VCAM-1水平、mRNA表達水平的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。實驗重復8次。

2結果

2.1MEF2A RNAi效率測定及體外靶片段篩選結果見表1。由表1可知，NC組與對照組相比，MEF2A表達水平差異無統計學意義；RNAi組與對照組、NC組MEF2A表達水平進行比較，差異均有統計學意義，且MEF2A靶點B最有效，沉默效率最高，因此，確定靶點B為實驗的目標片段。

2.2ICAM-1和VCAM-1在對照組、NC組和RNAi組上清液中的表達結果見表2。由表2可知，對照組、NC組小鼠上清液中ICAM-1、VCAM-1的水平均低于RNAi組。

表1　MEF2A RNAi效率測定及體外靶片段篩選結果

表2　各組小鼠上清液中ICAM-1、VCAM-1水平的比較　μg/L

2.3MEF2A RNAi對小鼠主動脈內皮細胞ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達的影響結果見表3。由表3可知，NC組與對照組相比，小鼠主動脈內皮細胞ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達水平差異無統計學意義；RNAi組ICAM-1及VCAM-1 mRNA表達水平增高。

表3　各組小鼠主動脈內皮細胞ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達水平的比較

3討論

在各種病因啟動下，血管內皮細胞受損,平滑肌細胞增殖形成新生內膜，導致內膜增厚、管腔狹窄，形成AS[3]。

MEF2A蛋白與血管的完整性和血管內皮細胞的生存有關，有絲分裂原激活蛋白的蛋白激酶ERK5參與內皮細胞的存活和增殖信號的傳導[4]。Kato等[5]認為,ERK5/MEF2通路通過激活KLF2轉錄因子調節血流介導的內皮完整性。Olsen等[6]發現，MEF2-HDAe信號在維持血管的完整性方面有重要作用，MEF2A在血管內皮細胞上高表達,對促進血管內皮細胞的存活和血管重塑具有重要作用。細胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1屬免疫球蛋白超家族成員，主要以低水平表達于內皮細胞，功能上主要介導單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞與內皮細胞黏附，促進淋巴細胞聚集[7]。在一般生理狀態下，非活化內皮細胞ICAM-1、VCAM-1表達水平較低；而在體內炎性反應的病理條件下，ICAM-1、VCAM-1在血管內皮出現高表達[8]。在AS病變形成早期，ICAM-1、VCAM-1促進單核細胞向內皮黏附、遷移，通過修飾低密度脂蛋白促進細胞趨化因子產生，使單核細胞分化增殖，產生更多的細胞炎癥因子；在AS病變進展期，ICAM-1、VCAM-1促進已進入病灶的單核細胞和T淋巴細胞激活，促進細胞間的相互作用；隨著AS病程的進展，ICAM-1、VCAM-1介導更多的細胞進入斑塊，促進斑塊發展，并使斑塊的不穩定性增加[9]。

在該研究中作者發現，小鼠主動脈內皮細胞MEF2A高表達，選擇沉默效率最高的目的基因片段對小鼠主動脈內皮細胞進行RNAi后，MEF2A蛋白及mRNA表達明顯受到影響。正常小鼠主動脈內皮細胞ICAM-1、VCAM-1及其mRNA的表達相對較低，轉染MEF2A RNAi 慢病毒載體后，ICAM-1、VCAM-1及其mRNA表達均明顯增高。NC組與對照組相比未發現ICAM-1、VCAM-1及其mRNA表達有任何差別，這說明NC病毒轉染不能降低ICAM-1、VCAM-1及其mRNA的表達，也說明MEF2A RNAi的有益作用并不是來源于慢病毒轉染所引起的非特異性免疫反應。該研究結果還顯示，正常小鼠主動脈內皮細胞ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達較少，MEF2A RNAi后，ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達明顯上升，提示MEF2A參與了血管內皮黏附功能和炎癥反應的調節。所以，慢病毒介導的MEF2A RNAi可以有效降低小鼠主動脈內皮細胞MEF2A活性及其mRNA的表達，同時，促進AS相關因子ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA的表達，從而在AS的形成中發揮重要作用。

參考文獻

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(2015-10-04收稿責任編輯姜春霞)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.017

中圖分類號R541.4

關鍵詞小鼠；肌細胞增強因子2A；RNA干擾；ICAM-1；VCAM-1

Effects of RNA interference of myocyte enhancer factor 2A on expressions of MEF2A, ICAM-1， and VCAM-1 in mice aortic endothelial cells

ZHOU Wenping1),ZHANG Hui2),ZHANG Jinying2)

1)DepartmentofCardiovascularMedicine,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofCardiovascularMedicine,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsmouse;myocyte enhancer factor 2A;RNA interference;ICAM-1;VCAM-1

AbstractAim: To identify the effects of RNA interference of myocyte enhancer factor 2A(MEF2A) on the expressions of MEF2A and relative inflammatory genes ICAM-1 and VCAM-1 in mice aortic endothelial cells. Methods: The aortic endothelial cells in mice were cultivated, then MEF2A lentivirus RNA interference or negative control lentivirus(NC) were built and transfected aortic endothelial cells in mice. The cells were allocated into control group(without lentivirus), NC group, and MEF2A RNA interference group. MEF2A,ICAM-1, and VCAM-1 expressions were detected by ELISA, and mRNA levels of MEF2A,ICAM-1, and VCAM-1 were further examined by RT-PCR.Results: In the control group, NC group, and MEF2A RNA interference group,ICAM-1 expression in the supernatant fluid were (1.133±0.182),(1.267±0.115),and (2.249±0.185) μg/L, VCAM-1 expression in the supernatant fluid were (2.382±0.204),(2.253±0.281),and (5.077±0.198) μg/L. There was no significant difference in ICAM-1 or VCAM-1 expression in the supernatant fluid between NC group and the control group(P>0.05).When MEF2A RNA interference group was compared with the control group and NC group, there were significant differences(P<0.05).Conclusion: Lentivirus-mediated RNA interference of MEF2A could inhibit the expression of MEF2A and promote intravascular ICAM-1, VCAM-1 activity mRNA expression.

*河南省高校科技創新團隊基金資助項目14IRTSTHN018

*：與對照組和NC組相比，P<0.05;#:與其他3個RNAi組相比，P<0.05。

*：與對照組和NC組相比，P<0.05。

*：與對照組和NC組相比，P<0.05。