施硫、控水和施肥對藍莓葉片葉綠素熒光特性的影響①

張會慧，周 琳，劉 昆，李可心，魏殿文，張 悅*（ 東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 50030； 黑龍江省科學院自然與生態研究所，濕地與生態保育國家地方聯合工程實驗室，林下經濟資源研發與利用協同創新中心，黑龍江省特色動植物利用工程技術研究中心，哈爾濱 50040）

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施硫、控水和施肥對藍莓葉片葉綠素熒光特性的影響①

張會慧1，周 琳2，劉 昆1，李可心1，魏殿文2，張 悅2*
（1 東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030；2 黑龍江省科學院自然與生態研究所，濕地與生態保育國家地方聯合工程實驗室，林下經濟資源研發與利用協同創新中心，黑龍江省特色動植物利用工程技術研究中心，哈爾濱 150040）

摘 要：在我國藍莓主產區大興安嶺利用正交設計方法研究了施硫、控水和施肥 3個因素對藍莓葉片葉綠素熒光特性的影響，擬確定3個因素對藍莓葉片PSⅡ反應中心功能的影響順序及最佳水平。結果表明：3個因素互作對藍莓葉片葉綠素熒光參數影響顯著，且不同處理下各熒光參數均明顯優于對照。極差分析和偏最小二乘回歸結果均顯示，3個因素對藍莓葉片PSⅡ反應中心功能的影響順序為控水＞施硫＞施肥。另外，偏最小二乘回歸方程中的二次項系數結果揭示3個因素均存在一個最適宜范圍，當超過這一范圍時會起到相反的作用。綜合極差分析結果中各因素最優水平可以確定：施用硫磺70 ～ 80 g/m2，土壤相對含水率約45% ～ 60%，硫酸鉀復合肥5 ～ 7.5 g/株為最適宜我國大興安嶺地區藍莓“美登”的農藝措施。

關鍵詞：藍莓；正交設計；硫磺；控水；施肥；葉綠素熒光

藍莓為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）落葉灌木，果實甜酸適口，風味獨特，既可鮮食又可加工果酒、果汁和果醬等［1］。藍莓果實中含有豐富的花色素苷和維生素等，具有較高的營養和保健價值［2-3］，是抗氧化作用最強的水果之一。因此，藍莓堪稱“世界第三代水果之王”［4］，是目前保健功能果品的研究熱點之一。但是由于藍莓栽培過程中對生長環境的要求相對較高，特別是需要相對較低的土壤pH，適宜的土壤水分和養分含量等［5-7］。在藍莓種植過程中，為尋求最適宜當地條件的調控技術，常常進行多因素共同處理，因此不但要考慮單因素的正效應，還要考慮多因素之間的耦合或拮抗效應［8］。由于藍莓獨特的喜酸性土壤特性，因此，目前我國藍莓人工栽培過程中常常采用施硫磺、硫酸鋁等一些酸性肥料的方法調控土壤pH［9-10］。硫磺在 S 氧化為 SO42-的過程中可以產生 H+以達到降低土壤 pH 的目的［11-12］，并且SO42-具有改變土壤電荷的性質［13］，因其成本低、作用效果明顯在鹽堿地土壤酸堿度改中得到了廣泛的應用［14］。目前已有藍莓人工種植中施用硫磺促進其生長的報道［15］。正交設計是研究多因素多水平的一種設計方法，它是根據正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點，是一種高效、經濟的試驗設計方法［16-17］。偏最小二乘回歸（PLSR）是一種集多元線性回歸分析、典型相關分析和主成分分析等功能于一體的多元統計分析方法，可以有效克服其他回歸方程在自變量間存在多重相關性時導致估計結果誤差較大且不穩定等弊端［18-19］。植物葉片的葉綠素熒光參數是反映植物光合能力的重要指標，特別在研究光系統功能方面發揮著重要的作用［20-21］。本研究設計施硫、控水和施肥 3 個試驗因素，每個試驗因素設置 4 個梯度水平，利用正交設計法研究了3 個因素對藍莓葉片 PSⅡ 功能的影響，并利用PLSR 法進行了不同因素對藍莓葉片葉綠素熒光參數的數學擬合，以尋求最優的試驗組合，為藍莓栽培過程中的綜合調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和處理

試驗于 2011—2014 年在大興安嶺地區阿木爾林業局中心苗圃藍莓人工栽培試驗示范區進行，試驗地基本土壤理化性質：堿解氮 305.96 mg/kg、速效磷 19.59 mg/kg、速效鉀 149.83 mg/kg、有機質21.7 g/kg、pH 5.06。供試藍莓品種為矮叢類“美登”，2011年移栽（移栽苗 3 年生），試驗采用壟作方式，壟長 160 m，壟寬 1.3 m，種植株距 0.6 m，即每壟種植 236 株。

正交試驗的 3 個因素分別選取施硫（A）、控水（B）和施肥（C），每個因素設置 4 個水平，分別以 1、2、3 和 4 表示，具體方案見表 1。其中，以不施硫磺、無灌溉和不施肥為處理 1，即對照（CK）。施硫處理硫磺的施用方式在移栽前撒施，然后 15 cm 深翻混勻，施用硫磺在 2011 年移栽前施用一次。控水處理是以土壤相對含水率為標準，隨時監控各處理 0 ～ 20 cm土層土壤相對含水率，隨時采用試驗地的噴灌裝置進行水分控制，控水試驗在 2011—2014 年均按相同梯度進行控制，其中 0 水平為無灌溉措施、無防雨棚的自然生長處理。施肥處理選用的肥料為硫酸鉀復合肥，施肥方式采用單株環施法，施肥深度約 10 cm。施肥試驗的肥料在 2011—2014 年每年的 6 月施用。本研究于 2014 年 8 月進行葉片葉綠素熒光參數的測定。

表1 正交處理各因素水平及編號Table 1 Levels and codes of the experimental factors

1.2 測定項目和方法

葉片葉綠素熒光參數的測定：利用暗適應夾對藍莓新生枝條上的中部完全展開葉片進行 0.5 h 的暗適應，采用便攜式脈沖調制熒光儀 FMS-2（Hansatch公司，英國）測定初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）和可變熒光（Fv），以及光適應下的最大熒光（Fm′）、光適應下的最小熒光（Fo′）及穩態熒光（Fs），計算 PSⅡ 最大光化學效率（Fv/Fm）、實際光化學效率（ФPSⅡ）、光化學淬滅系數（qP）和非光化學淬滅（NPQ）等，其中，Fv/Fm=（Fm/Fo）/Fm，ФPSⅡ=（Fm/Fs）/Fm′，qP=（Fm′-Fs）/（Fm′-Fo′ ），NPQ=（Fm/Fm′ ）/Fm′［22］。

1.3 數據處理和統計方法

運用Excel和DPS軟件對試驗數據進行統計分析，結果中的數據為3次重復的平均值±標準差（SE），采用最小顯著差異法（LSD）進行不同處理結果之間的多重比較。

分別計算各葉綠素熒光參數在不同因素和不同水平下的K值及極差R，其中K值即各因素不同水平所對應的試驗指標和，由K值大小可以判斷各因素優水平和優組合。各因素素的極差R=max（Kj）-min（K），R越大，說明該因素對試驗指標的影響越大，根據R大小，可以判斷因素的主次順序。

利用 DPS軟件中的偏最小二乘回歸分析法（PLSR）擬合不同葉綠素熒光參數Fv/Fm（y1）、ФPSⅡ（y2）、qP（y3）和NPQ（y4）與施硫磺量（x1）、土壤相對含水率（x2）和施肥量（x3）3個因子間的偏最小二乘回歸方程，擬合出不同因素互作下藍莓葉片 PSⅡ光化學活性最優的因素組合。

2 結果與分析

2.1 葉綠素熒光參數

由圖 1結果可以看出，不同處理下藍莓葉片的Fv/Fm變化幅度相對較小，均維持在 0.8左右，但處理2 ～ 16 的Fv/Fm均較處理1（即CK）有不同程度的增加，其中處理6、11、13增加幅度較大，其他處理與CK差異不顯著，即處理6、11、13在一定程度上提高了藍莓葉片的光化學活性，但不同處理均沒有使藍莓葉片發生光抑制現象。與Fv/Fm相比，藍莓葉片的 ФPSⅡ變化幅度較大，說明反映藍莓葉片的光化學活性方面，ФPSⅡ較Fv/Fm更具代表性。但同樣也表現為CK處理ФPSⅡ最低，ФPSⅡ相對較低的為處理為5、9和16，而ФPSⅡ值相對較高的處理分別為處理2、3、7、11和15，分別較處理1增加了25.03%、23.29%、29.90%、30.77%和29.14%。

圖1 施硫、控水和施肥處理下藍莓葉片的Fv/Fm和ФPSⅡFig.1 Effects of sulphur application， water-controlled irrigation and fertilization on Fv/Fmand ФPSⅡin leaves of blueberry

由圖2可以看出，不同處理藍莓葉片的qP存在較大的變異，但與 CK相比，其他處理藍莓葉片的qP均有不同程度的增加，其中增加幅度較小的為處理9和處理16，與CK無顯著差異，增加幅度相對較大的為處理7和處理15，均顯著高于CK，此時土壤相對含水率均維持在45% ～ 60%，即土壤水分對藍莓葉片qP的影響相對較大。與其他葉綠素熒光參數不同，不同處理下藍莓葉片的NPQ與CK相比整體呈降低趨勢，但處理8和處理16與CK基本無明顯差異，并且處理9藍莓葉片的NPQ卻較CK稍有增加，但未達顯著差異水平。其中藍莓葉片NPQ最低的為處理15，較CK降低了39.84%（P＜0.05）。

圖2 施硫、控水和施肥處理下藍莓葉片的qP和NPQFig.2 Effects of sulphur application， water-controlled irrigation and fertilization on qPand NPQ in leaves of blueberry

2.2 極差分析

表 2顯示了各因素互作下藍莓葉片葉綠素熒光參數的K值及其極差結果。從表2中可以看出，各因素對 4個葉綠素熒光參數影響順序均表現為控水（B）＞施硫（A）＞施肥（C），即對藍莓葉片各葉綠素熒光參數影響最大的因素均為 B（控水，即土壤相對含水率），次要因素為施硫磺量，而施肥量對藍莓葉片葉綠素熒光參數的影響最小。K值分析結果表明，Fv/Fm、ФPSⅡ和NPQ均在A因素為水平3時K值最大，qP為A因素為水平4時K值最大，各參數均在B因素為水平3時K值最大，除NPQ在C因素為水平3時 K值達最大值外，Fv/Fm、ФPSⅡ和qP均在C因素為水平2時達最大K值，即Fv/Fm和ФPSⅡ的最優組合為A3B3C2，qP的最優組合為A4B3C2，NPQ的最優組合為A3B3C3。

2.3 偏最小二乘回歸分析

為進一步明確不同因素的最佳水平，分別建立了葉綠素熒光參數Fv/Fm、ФPSⅡ、qP和NPQ（分別以y1、y2、y3和y4表示）與施硫磺量（x1）、土壤相對含水率（x2）和施肥量（x3）之間的偏最小二乘回歸數學方程。通過方程（1）～（4）可以看出，各方程的常數項均與各葉綠素熒光參數的基準值接近，因此，方程的擬合效果相對較好。y1、y2和y33個方程中的x1、x2和x3一次項系數均為正值，y4方程中的x1、x2和 x3一次項系數均為負值，說明3個因素對Fv/Fm、ФPSⅡ和qP的影響均為正效應，而對NPQ的影響為負效應。并且y1、y2和y33個方程中的一次項系數以及y4方程中一次項系數絕對值均表現為x2＞x1＞x3，即土壤相對含水率對各葉綠素熒光參數的影響最大，其次為施用硫磺量，施肥量對葉綠素熒光參數的影響最小。y1、y2和y33個方程中的x1、x2和x3二次項系數均為負值，而 y4方程中的 x1、x2和 x3二次項系數均為正值，說明 3個因素對 Fv/Fm、ФPSⅡ和 qP的影響均有一個適宜范圍，當超過這一范圍時會起到相反的作用，而對于y4即NPQ則表現為隨著各單因素值的增加，藍莓葉片 NPQ持續增加。單因素互作結果表明，y1、y2和y33個方程中的x1x2和x1x3項系數均為負值，即施用硫磺和土壤相對含水率以及施用硫磺和施肥之間存在一定的拮抗效應，而x2x3項系數為正值，即土壤相對含水率和施肥量之間存在促進效應，同樣，y4方程中各因素互作效應的變化趨勢也與y1、y2和y33個方程相反。

表2 多因素處理下藍莓葉片葉綠素熒光參數的極差分析Table 2 Range analysis of chlorophyll fluorescence parameters in leaves of blueberry under different treatments

3 討論

植物葉片的葉綠素熒光特性是反映植物光合能力的重要指標，特別是在反映植物光能的吸收、利用以及 PSⅡ反應中心光化學活性方面發揮著重要的作用［23］。本研究中，不同因素正交處理下藍莓葉片的Fv/Fm、ФPSⅡ和qP均較處理1（CK）有不同程度的增加，說明施硫、控水和施肥3個因素互作均可以提高藍莓葉片的 PSⅡ光化學活性，而不同處理下藍莓葉片的NPQ整體較CK呈降低趨勢，即3個因素正交處理可以降低藍莓葉片吸收光能以無效熱能形式的耗散，保證光化學反應中正常的能量供應。不同處理下藍莓葉片的Fv/Fm均維持在0.8左右，沒有大幅度變化，Fv/Fm是反映PSⅡ光抑制的重要指標，這說明不同處理下藍莓葉片僅存在光化學活性方面的差異，并沒有明顯光抑制現象的發生。整體來看，不同處理下藍莓葉片PSⅡ光化學活性相對較低的為處理9即施用硫磺70 g/m2、不進行灌溉和施肥10 g/株，其原因可能是由于在土壤含水量較低時，施肥量的增加使土壤水勢進一步降低，導致植物吸收水分更加困難［24-25］，進而導藍莓物的光合能力受到限制，并且此時施用硫磺量可能未達到藍莓生長所需的最適pH。處理9藍莓葉片的NPQ較CK稍有增加，NPQ雖與光化學反應競爭能量，但在逆境下NPQ的增加可以有效耗散過剩光能，以免PSⅡ反應中心受過剩光能的破壞［26-27］。施用硫磺會通過降低土壤的 pH而影響養分的有效性，在一定程度上促進藍莓根際土壤酶的活性，提高土壤養分的活化［28］，這與施肥的作用相似，但這也降低土壤水勢，因此處理9藍莓葉片NPQ增加可能是在無灌溉和施硫及施肥等因素共同作用導致土壤水勢降低時藍莓葉片啟動了熱耗散機制進行過剩光能的利用，這也是此時藍莓葉片沒有發生光抑制的重要原因。不同處理下藍莓葉片 PSⅡ光化學活性相對較高的為處理7和處理15等，即保證適宜的土壤相對含水率、合理施用硫磺和施肥，這也說明不同因素之間存在明顯的耦合效應。

但本研究中不同參數的變化趨勢并不完全一致。因此，為選擇最適宜的互作條件，有必要對不同因素影響順序和不同因素最佳水平進行綜合考慮。極差分析結果中R值可以判斷各因素的主次順序，而K值則判斷各因素的最優水平和最優組合［29］。本研究結果表明，3個因素對4個葉綠素熒光參數的極差R值均表現為 B＞A＞C，即對藍莓葉片各葉綠素熒光參數影響最大的因素均為B（土壤相對含水率），次要因素為施硫磺量，而施肥量對藍莓葉片葉綠素熒光參數的影響最小。通過建立的偏最小二乘回歸方程可以看出，Fv/Fm、ФPSⅡ和 qP方程中土壤相對含水率（x2）的一次項系數以及NPQ的x2一次項系數絕對值也明顯大于施硫磺量（x1）和施肥量（x3）的一次項系數，這同樣說明土壤相對含水率為影響藍莓葉片 PSⅡ反應中心光化學活性的第一因素，而施用硫磺對藍莓葉片PSⅡ反應中心光化學活性的影響程度大于施肥，這與極差R值的結果相符。K值分析結果表明，各參數的A因素最佳水平為3或4，B因素最佳水平為3，而C因素的最佳水平為2或3，均不是在各因素的最高水平使藍莓葉片 PSⅡ反應中心光化學活性達最大值，即各因素均的最佳水平均有一個明顯的極限值，通過Fv/Fm、ФPSⅡ和qP的偏最小二乘回歸方程中各因變量x1、x2和x3的二次項系數均為負值也可以說明3個因素對藍莓葉片 PSⅡ反應中心光化學活性的正效應均存在一個適宜范圍，當超過這一范圍時會起到相反的作用。偏最小二乘回歸方程中目標函數值 0.86 的x1、x2和x3因素最優水平分別為4、2.3和1.7，即施用硫磺80 g/m2、土壤相對含水率約45% ～ 60%，施肥量在5 ～ 7.5 g/株，這與極差分析中R值結果基本相符。

4 結論

施硫、控水和施肥 3 個因素互作對藍莓葉片葉綠素熒光參數影響顯著，并均在不同程度上提高了藍莓葉片的 PSⅡ反應中心光化學活性。3個因素中，土壤相對含水率是影響藍莓葉片 PSⅡ反應中功能的第一因素，其次為施用硫磺量，影響最小的為施肥，并且不同因素的正效應均有一個適宜范圍。結合極差分析和偏最小二乘回歸結果，我國大興安嶺地區藍莓 PSⅡ反應中心最優的農藝措施建議為施用硫磺 70 ～ 80 g/m2、土壤相對含水率約 45% ～ 60%，施肥量在 5 ～ 7.5 g/株。

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中圖分類號：S157.3

DOI:10.13758/j.cnki.tr.2016.03.011

基金項目：①國家科技支撐項目（2011BAD08B01-03）資助。

* 通訊作者（zyszy1962@163.com）

作者簡介：張會慧（1986—），男，內蒙赤峰人，講師，主要從事植物生理生態學研究。E-mail: xtwfwf@126.com

Sulphur Application， Water-controlled Irrigation and Fertilization on Chlorophyll Fluorescence Parameters in Leaves of Blueberry

ZHANG Huihui1， ZHOU Lin2， LIU Kun1， LI Kexin1， WEI Dianwen2， ZHANG Yue2*
（1 College of Resources and Environment， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China； 2 Natural Resources and Ecology Institute， National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation， Collaborative Innovation Center for Development and Utilization of Forest Resource， Characteristic Animal and Plant Utilization Engineering Technology Research Center of Heilongjiang Province， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin 150040， China）

Abstract:The effects of sulphur powder application， water-controlled irrigation and fertilization on chlorophyll fluorescence parameters in leaves of blueberry were investigated using orthogonal design.The main objective was to identify the order of the three factors and the best level on PSⅡ reaction center function in leaves of blueberry.The results showed that PSⅡ reaction center function in leaves of blueberry was affected by the three factors obviously， and the fluorescence parameters under different treatments were significantly better than that of control.Range analysis and partial least squares regression showed that the effects of the three factors on PSⅡ reaction center function in leaves of blueberry followed the order: water-controlled irrigation＞application of sulphur powder＞fertilization.In addition， quadratic term coefficient of partial least squares regression equation showed that the three factors had the most suitable range.The opposite effect occurred out of this suitable range.Comprehensive analysis suggested that the best agronomic measures in the Greater khingan mountain area of China are: 70-80 g/m2of sulfur powder， soil relative water content at 45%-60%， potassium sulphate fertilizer of 5-7.5 g/plant.

Key words:Blueberry； Orthogonal design； Sulphur； Water-controlled irrigation； Fertilization； Chlorophyll fluorescence