GC—MS/MS同位素內標法測定肉制品中N—二甲基亞硝胺

周佳 孫嘉茵 李宇茜 唐維英 徐小平

摘 要：采用同位素內標定量，建立一種快速、準確測定各種肉制品N-二甲基亞硝胺的GC-MS/MS法。樣品中加入D6-N-二甲基亞硝胺內標，經水蒸氣蒸餾、二氯甲烷提取、分離、濃縮，用多反應監測模式（MRM）進樣分析。色譜柱為HP-Innowax毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），氦氣為載氣，氮氣為碰撞氣，流量為1.4 mL/min。結果表明：該方法檢測范圍在10～300 ng/mL內，線性關系良好y=77.16x-500.16（r2=0.999 6），精密度RSD為2.36%；回收率為82.9%～99.5%，檢出限0.2 μg/kg。對4種不同來源的肉制品共40批次進行檢測，檢出13批次，但均未超過限量（3 μg/kg）。該方法靈敏、簡便、準確、重復性好，可作為肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測的好方法。

關鍵詞：N-二甲基亞硝胺；同位素內標；GC-MS/MS；多反應監測模式；優化

文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2016）09-0046-04

0 引 言

N-二甲基亞硝胺是一種很強的化學致癌物質，有40多種動物包括靈長類易于感染N-亞硝胺引起癌變[1-2]，肉制品中大多會添加護色劑亞硝酸鈉，現未找到合適的替代物，而亞硝酸鹽在制作肉過程中很容易和次級胺類物質反應產生致癌物質N-亞硝胺類物質，一次攝入過多會損傷肝臟和破壞血小板，出現嚴重的急性中毒癥狀，長期食用會導致肝硬化，新鮮的肉一般不含N-亞硝胺，而腌制、鹵制的肉常常含有N-亞硝胺[3-5]，又以N-二甲基亞硝胺檢出率最高[6]，一般會對肝、腎、肺產生致癌性作用，在培根、腌肉、香腸等肉制品中經常被檢出，國家對肉制品中N-二甲基亞硝胺的限量是3.0 μg/kg[7]，所以建立高靈敏度，高準確性，低檢出限的方法很有必要。前處理方面，筆者發現由于N-二甲基亞硝胺具有半揮發性，濃縮時很容易損失，嘗試加入同位素內標D6-N-二甲基亞硝胺，使定量更加準確；檢測方式方面，目前有關N-亞硝胺的檢測方法主要有GC-MS選擇離子掃描模式（SIM）測定[8-11]，現在國標方法[12]第一法所提及的氣相-熱能分析儀不普及，很多實驗室不適用，筆者曾用SIM進行檢測，發現基質干擾太大，常出現樣品中加入標液卻無法定性的情況，準確度極差，本實驗在這個基礎上進行改進，采用GC-MS/MS同位素內標法多反應監測模式（MRM）檢測肉制品中N-二甲基亞硝胺，基質干擾小，能有效地對目標物定性定量，靈敏度高。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

Aglilent 7890A-7000B氣相色譜-質譜質譜聯用儀（美國安捷倫儀器公司）；色譜柱：HP-Innowax毛細管柱30 m×0.32 mm，0.25 μm[12]（美國安捷倫儀器公司）；電子天平（Sartorius，CPA 225D），旋轉蒸發儀（Buchi，R-215）；漩渦振蕩器（IKA，MS3digital）；超聲清洗機（Auto science，AS5150B）；高速離心機（Eppendorf，Centrifuge 5810R）。

1.2 試 劑

二氯甲烷（色譜級）、氯化鈉、硫酸、超純水；N-二甲基亞硝胺標液（Accustandard：Lot：214071210；濃度：100.8 μg/mL）；D6-N-二甲基亞硝胺（CDN ISOTOPE Lot：X323P9，純度：99.5%），硫酸溶液：90 mL超純水，緩慢加入30 mL濃硫酸，混勻，放至室溫，即得。

1.3 標準溶液及內標溶液的配制

N-二甲基亞硝胺標準工作液：精密量取N-二甲基亞硝胺標液0.1 mL，置于10 mL棕色量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，搖勻，即得（質量濃度為1.008 μg/mL）。D6-N-二甲基亞硝胺標準工作液：精密稱取D6-N-二甲基亞硝胺標準品10.14 mg，置于50 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，得D6-N-二甲基亞硝胺儲備液（質量濃度約為0.2 mg/mL，4 ℃以下保存，3個月內使用）；精密量取上述儲備液100 μL，置10 mL量瓶中，二氯甲烷稀釋并定容至刻度，搖勻，得內標使用液（2 μg/mL，4 ℃以下保存，1周內使用）。

1.4 色譜條件

1.4.1 GC條件

進樣口溫度：250 ℃；進樣量：2 μL，進樣方式：不分流；載氣：高純氦氣，流量：1.4 mL/min；升溫程序：50 ℃保持4 min，以10 ℃/min升至160 ℃，270 ℃后運行3 min。

1.4.2 MS/MS條件

電離方式為電子轟擊電離（EI），電離能量為70 eV； 離子源溫度：230 ℃；接口溫度：280 ℃；四級桿溫度：150 ℃；碰撞氣：氮氣；溶劑延遲時間：5 min；掃描模式：MRM（多反應監測），定量離子m/z（質荷比）74>44，定性離子m/z 74>42；內標定量離子m/z 80>50；碰撞能量：m/z 74>44為5 V，m/z 74>42為20 V；m/z 80>50為10 V。

1）用Scan模式確認

N-二甲基亞硝胺的保留時間及質譜圖相關信息（見圖1、圖2），圖中可以確認N-二甲基亞硝胺的保留時間為8 min。

2）離子篩選及MRM模式電壓的選擇

在Product ion模式下固定m/z 74的母離子，分別用5，10，20，30 V電壓進行碰撞，由于N-二甲基亞硝胺的分子量較小m/z 74，可以選擇的碎片離子不多，有44、43、42、30，考慮到30分子量太小，容易受干擾，沒有再優化，如圖3所示。

在MRM模式下分別選用電壓5，10，20，30 V對m/z 74>44、m/z 74>42、m/z 74>43進行篩選，發現m/z 74>43響應比較低，并且旁邊易出現干擾峰（如圖4所示），最終選定m/z 74>44和m/z 74>42，同時也選擇了m/z 74>44為5 V，m/z 74>42為20 V，m/z 74>44響應較m/z 74>42高，m/z 74>44為定量離子，響應好、干擾小。

1.5 樣品的預處理

取樣品約50 g，精密稱定，加入內標使用液100 μL，使與樣品混勻，置于水蒸氣蒸餾裝置中，加入50 mL水，搖勻，在蒸餾瓶中加入60 g氯化鈉，充分搖動使氯化鈉溶解，將蒸餾瓶與水蒸氣發生器及冷凝管連接好，在錐形瓶中加入30 mL二氯甲烷及少量冰塊，收集約200 mL的餾出液，在錐形接收瓶中加入40 g氯化鈉和3 mL硫酸溶液，攪拌，使氯化鈉全部溶解，轉移至分液漏斗中，振搖提取，靜置分層，分取二氯甲烷層，40 ℃以下旋轉至近干，用二氯甲烷轉移并定容至1 mL。

1.6 方法評價

1.6.1 標準曲線的繪制

分別量取濃度約為1 μg/mL的N-二甲基亞硝胺標準工作液（10，30，50，100，150，200，300 μL）及內標使用液各100 μL，加二氯甲烷配制成濃度分別為10.08，30.24，50.4，100.8，151.2，201.6，302.4 ng/mL的標準工作液。

將制備好的N-二甲基亞硝胺標準測定液分別注入GC-MS/MS，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標，以N-二甲基亞硝胺得濃度（ng/mL）為橫坐標繪制標準曲線為y=77.16x-500.16（r2=0.999 6），結果表明N-二甲基亞硝胺濃度在10～300 ng/mL范圍內線性良好，如圖5所示。

1.6.2 方法精密度試驗

用該方法對同一樣品進行反復測定（n=6），考察含量的精密度，RSD為2.36%，結果符合精密度要求，如表1所示。

1.6.3 準確度考察

稱取空白樣品6份，進行3個濃度的加標回收試驗，分別加入N-二甲基亞硝胺標準工作液（1.008 μg/mL）30，100，150 μL，形成低中高單個濃度，測定計算回收率，結果如表2所示。

1.6.4 檢出限

稱取空白樣品50 g，置于水蒸氣蒸餾裝置的蒸餾瓶中，加入N-二甲基亞硝胺標準使用液（1.008 μg/mL）10 μL及內標使用液100 μL，使與樣品混勻，加入水50 mL，混合均勻，加入氯化鈉60 g，照1.4樣品處理操作，制備檢出限工作液，注入GC-MS/MS，測得信噪比，按S/N=3∶1計算，折算N-二甲基亞硝胺檢出限為0.2 μg/kg。（檢出限（μg/kg）=檢出限工作液濃度（ng/mL）×稀釋體積（mL）/取樣量（g）×3/測得信噪比×1 000/1 000）。

1.7 專屬性

分別注射空白基質溶液和對照品溶液，N-二甲基亞硝胺保留均較好，空白基質未見干擾，對照品與溶劑空白反復進樣也未見交叉污染，專屬性較好，如圖6所示。

1.8 測 定

將樣品測定液注入GC-MS/MS得到峰面積，從標準曲線中查出相應得濃度（ng/mL），根據稀釋倍數和稱樣量可與算出樣品得含量（μg/kg），結果如表3所示。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理的選擇

考慮到食品基質復雜，為得到準確的結果，選取4種不同來源肉制品（包括豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉），采取不同的提取方式，考察溶劑提取和蒸餾提取，用二氯甲烷溶劑超聲提取時發現，由于肉制品（如豬肉）脂肪含量可以達到90%以上，在濃縮時，提取液會出現一塊塊固狀的油脂，實驗無法繼續，本實驗采用水蒸汽蒸餾方式，油脂、蛋白質無法隨目標物蒸餾出來，能夠獲得理想的提取效果。

2.2 肉制品中N-二甲基亞硝胺的檢測常見問題與采用GC-MS/MS檢測的優勢

曾用單氣質SIM模式進行測定，由于N-二甲基亞硝胺的分子量（74）太小，容易受多種分子離子干擾，食品基質復雜，基質效應特別明顯，常常出現加入標準液卻定性不了，造成定性上的誤差，用GC-MS/MS的MRM模式，排除了基質帶來的干擾，靈敏度更高。

2.3 采用內標法的優勢

在進行前處理時，發現樣品濃縮及液液萃取過程很容易使目標物流失，采用D6-NDMA標準品為內標，選取內標定量離子m/z 80>50，可減少外標法對回收率的影響，使目標物定量更加準確。

2.4 樣品測定

應用本方法對4中不同來源基質樣品（包括豬肉制品20批次、牛肉制品10批次、雞肉制品5批次、鴨肉制品5批次）共40批進行分析，檢測含有NDMA 13批次，含量在0～1 μg/kg之間，均未超過國家規定的限量3.0 μg/kg。

3 結束語

NDMA食品安全限度值比較低，為了達到檢測目的，樣品取樣量大，本方法保留國標中水蒸汽蒸餾法進行前處理，表面上效率比較低，但是由于樣品取樣量大，肉制品基質復雜，簡單的有機溶劑提取不太現實，后期凈化壓力極大，而采用水蒸汽蒸餾能有效除去大部分的雜質，并且對環境影響較小，對操作人員友好。本法采用水蒸汽蒸餾，同位素標記，建立GC-MS/MS檢測N-二甲基亞硝胺的新方法，結果表明，N-二甲基亞硝胺可通過GC-MS/MS的MRM模式，以同位素內標法被快速、靈敏的良好分離檢測，是肉制品中N-二甲基亞硝胺高效檢測的較好方法，可適用于日常食用肉制品的質量監控，提高人們的食肉安全性。

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（編輯：徐柳）