大鼠皮膚成纖維細胞在低密度培養條件下基質金屬蛋白酶9和13基因表達的抑制

劉譽 楊澤民

摘 要：為探索體外促進原代皮膚成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞的培養條件及原代皮膚成纖維細胞轉分化前后兩種狀態下經腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）刺激，其MMP基因的表達情況。利用Wistar大鼠真皮分離出的原代成纖維細胞為模型，分別以高密度與低密度將細胞培養于塑料界面，通過Western Blot和qRT-PCR檢測肌成纖維細胞的標志物α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達量；同時經TNF-α刺激后，利用qRT-PCR和明膠酶譜檢測高密度與低密度兩種狀態下MMP-9和MMP-13的表達及兩種狀態下MMP-9的活性。發現大鼠真皮中分離出的原代成纖維細胞在低密度培養條件下，可以有效地轉分化為肌成纖維細胞，其標志物α-SMA顯著上調；經腫瘤壞死因子刺激a，成纖維細胞在低密度培養條件下MMP-9和MMP-13對TNF-α刺激的響應程度較高密度培養時顯著降低。初步表明在大鼠真皮（dermis）中，原代成纖維細胞體外轉分化為肌成纖維細胞且MMP-9和MMP-13在肌成纖維細胞中下調的現象是細胞密度依賴型。

關鍵詞：基質金屬蛋白酶；原代成纖維細胞；密度培養；轉分化；腫瘤壞死因子

文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2016）09-0055-06

0 引 言

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類鋅離子依賴的肽鏈內切酶，屬于金屬蛋白酶家族。目前已發現至少20種MMPs，按照作用底物可分為明膠酶、膠原酶、基質溶解酶和膜型基質金屬蛋白酶[1]。MMPs在結構上具有較高的同源性，大多數MMPs都包括前肽結構域、催化結構域和信號結構域等；其中，在MMPs的催化活性中心均發現Zn2+的存在[2]。

MMPs的表達具有細胞、組織特異性，其調控主要發生在轉錄水平、表觀遺傳學水平以及轉錄后水平[3]。在MMP基因的啟動子區，包含多種順式調節元件（cis-elements），根據細胞所處生理狀態的不同，多種反式作用因子（trans-activators）如AP-1、PEA3、Sp-1、β-catenin/TCF4及NF-κB被招募到MMP啟動子區，參與MMP的調控[4-6]。研究表明，MMP-9啟動子區高度甲基化能夠介導MMP-9發生表觀水平沉默，造成MMP-9在轉錄水平與蛋白水平下調[7-8]。除了轉錄水平與表觀水平的調控，MMP的調控還發生在轉錄后水平。研究表明，在成纖維細胞和前列腺癌細胞中，TGF-β及Hu家族蛋白能夠延長MMPs的mRNA半衰期，進而上調MMPs的表達。此外，MMPs蛋白的天然抑制劑TIMPs通過對MMPs的調節，與MMPs共同維持胞外基質的穩態[9]。

在之前的研究中表明，伴隨肝臟纖維化的發生，肝臟星狀細胞由靜息狀態轉分化為激活狀態的肌成纖維樣肝星狀細胞，在肌成纖維樣肝星狀細胞中，IIa型組蛋白去乙酰化酶（calss IIa HDACs）顯著上調并介導MMPs發生表觀遺傳學水平的沉默[10-12]，從而導致胞外基質沉積，肝臟纖維化持續。與肝臟纖維化類似的皮膚增生性瘢痕又稱皮膚纖維化，主要是由胞外基質（ECM）過度沉積造成，主要效應細胞為成纖維細胞（fibroblasts），皮膚成纖維細胞在纖維化的形成過程中，具有與肝臟星狀細胞相似的生理特點，如分泌膠原、參與胞外基質重構，并且兩者均由間充質干細胞分化而來[13-14]。

為了探索MMPs在皮膚纖維化過程中的表達變化，本文利用原代大鼠皮膚成纖維細胞為研究對象，體外建立高密度和低密度培養模型，分別模擬靜息狀態（正常生理狀態）和激活狀態（纖維化狀態）的成纖維細胞，并在炎癥因子TNF-α的刺激下，模擬皮膚受到急性損傷，檢測MMP-9和MMP-13的表達變化，為更好地模擬皮膚損傷和增生瘢痕形成提供新的體外實驗模型。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物

4周齡大SPF級雄性Wistar大鼠，體重120～150 g，由成都達碩實驗動物公司提供。

1.1.2 儀器與試劑

倒置顯微鏡（Nikon公司）；垂直電泳裝置、凝膠成像系統及梯度PCR儀（Bio-Rad公司）。DMEM高糖細胞培養基購自HyClone公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）購自美國Gemini公司；0.25%胰酶（含EDTA）、結晶紫染液購于Beyotime公司；1×PBS緩沖液、Trizol購自Invitrogen公司；TNF-α購于R&D公司；細胞培養級雙抗購自Thermo公司；明膠、Triton X-100購自Sigma公司；PVDF膜購自Bio-Rad公司；兔抗人克隆抗體alpha-SMA購自Abcam公司；兔抗人單克隆抗體Histone H3購自Cell Signal公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司；qRT-PCR試劑盒購自Bio-Rad公司；反轉錄試劑盒購自Roche公司。定量PCR引物由北京華大基因研究公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠皮膚原代成纖維細胞分離與培養

將雄性Wistar大鼠斷頸處死，在75%乙醇（ν∶ν）中浸泡5～10 min。在無菌條件下，剪取大鼠背部皮膚，用眼科剪刀去除皮下脂肪組織，1×PBS緩沖液反復漂洗后，將皮膚組織塊剪切成2 cm×2 cm的小塊，置于50 mL含有2×雙抗的DMEM培養基中，4 ℃過夜孵育。隨后在培養皿內將組織塊剪切成0.5 mm3的小塊，加入適量0.5%中性蛋白酶（dispase）在37 ℃，5% CO2條件下孵育2 h，去除表皮，將剩余的組織200 g 4 ℃離心5 min，棄上清。加入適量0.3%胰蛋白酶，37 ℃，5% CO2孵育1 h，用含有10%FBS DMEM完全培養基終止消化反應，最后用85 μm細胞篩去除多余的組織碎片，收集細胞懸液，500 g 4 ℃離心5 min，用新鮮的完全培養基重懸細胞。通過計數后，按照2×104個細胞/mL的密度接種于100 mm細胞培養皿，加入10.0 mL含10%FBS的DMEM培養基，置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。一般成纖維細胞會在24 h內貼壁，2～3 d后可以觀察到明顯的紡錘形。當原代皮膚成纖維細胞匯合度達到80%左右時，此時的細胞計為P0，后續進行常規傳代培養和凍存保種。

1.2.2 建立成纖維細胞密度培養模型

離體培養的原代大鼠皮膚成纖維細胞培養至第2代時，分別建立高密度與低密度培養模型。首先利用胰蛋白酶將原代大鼠皮膚成纖維細胞完全消化，加入適量完全培養基終止消化反應，800 g離心5 min，收集細胞。為研究MMP基因在不同密度成纖維細胞中的變化情況，將細胞密度調整為103個細胞/mL（低密度培養）和105個細胞/mL（高密度培養），分別接種于6孔板，加入10%FBS的DMEM培養基，繼續培養4 d，進行后續實驗。

1.2.3 結晶紫染色與炎癥因子刺激

成纖維細胞在高密度和低密度條件下培養4 d后，棄培養基，用預冷的1×PBS緩沖液漂洗2次，加入預冷的甲醇，室溫固定10 min。再用預冷1×PBS緩沖液漂洗2次，隨后加入結晶紫染液，室溫孵育30 min后，用1×PBS漂洗細胞，去除多余的染液，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。與此同時，向高密度和低密度培養條件下的成纖維細胞分別加入10 ng/mL TNF-α刺激24 h，收集細胞，檢測MMP-9和MMP-13的表達。

1.2.4 qRT-PCR與半定量PCR

按照Trizol說明書方法提取細胞總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測RNA的完整性，利用分光光度計檢測RNA濃度。取1.0μg總RNA，按照Roche反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，稀釋5倍后，進行實時熒光定量PCR檢測目的基因的表達水平。待檢測基因的引物如下：MMP-9上游引物5′-CAGACCA

AGGGTACAGCCTGTT-3′，下游引物5′-AGCGCATGG

CCGAACTC-3′；MMP-13上游引物5′-GCCCTATCC

CTTGATGCCATT-3′，下游引物5′-ACAGTTCAGGCT

CAACCTG-3′；α-SMA上游引物5′-CATCCGACCT

TGCTAACGGA-3′，下游引物5′-CATCTCCAGAGTC

CAGCACAATAC-3′；GAPDH上游引物：5′-CCTGG

AGAAACCTGCCAAGTAT-3′，下游引物5′-CTCGGC

CGCCTGCTT-3′。qRT-PCR反應體系為20.0 μL，反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，總共40個循環。采用2-ΔΔCT法計算相對表達量，以GAPDH作為內參。實驗重復3次。

1.2.5 Western Blot檢測

將高密度培養條件和低密度培養條件的細胞培養基棄盡，用預冷的PBS漂洗2～3次，用細胞刮輕柔將細胞盡數刮下，4 ℃ 800 g離心5 min收集細胞，用微量移液器將殘留的PBS吸盡，按6孔板每孔100 μL的量加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，冰上孵育30 min，裂解細胞以抽提細胞總蛋白，期間每10 min渦旋震蕩30 s。裂解產物4 ℃15 000 g離心30 min，收集上清，即為細胞總蛋白。利用BCA 法進行蛋白濃度測定，取100 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉移至0.45 μm PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。轉膜結束后分別加入一抗：anti-α-SMA（1∶1 000）、anti-Histon H3（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。PBST洗膜，10 min×3次，分別加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔的二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，PBST漂洗15 min×3次，ECL化學發光顯影，Bio-Rad全自動凝膠成像系統采集圖像，以Histon H3作為內參。實驗重復3次。

1.2.6 明膠酶譜

收集高密度與低密度培養條件下培養的成纖維細胞培養基，于4 ℃、10 000 g離心5 min，去除多余的細胞碎片，收集上清-80 ℃保存待用。將非還原性5×SDS-PAGE緩沖液與培養基按照一定比例混合進行樣品制備。配制含0.1%明膠的10%SDS聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，每孔上樣18.0 μL，100V，2 h進行凝膠電泳。電泳結束后，取出凝膠，置于2.5% Triton X-100溶液中室溫孵育1 h，隨后去離子水漂洗3次，再將凝膠置于明膠酶緩沖液（5 mmol/L CaCl2，

150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris，pH 7.5）37 ℃孵育16 h，最后進行高馬斯亮藍R-250染色觀察分析。

1.2.7 數據分析

所有實驗數據均以平均數±標準差（means±SD）表示，數據分析通過Prism software V6（GraphPad軟件）完成。數據統計采用不成對雙尾Students t檢驗，數據顯著性差異表示為“*”，“**”，分別代表P<0.05，P<0.01。所有實驗均重復3次。

2 結 果

2.1 高密度與低密度條件下成纖維細胞的形態

皮膚增生性瘢痕的形成過程中，靜息狀態的成纖維細胞在長期慢性炎癥作用下轉分化為具有收縮能力的肌成纖維細胞。為了模擬這兩種不同生理狀態的細胞類型，將原代大鼠皮膚成纖維細胞按照不同密度培養后，通過結晶紫染色發現，與高密度培養相比，低密度培養的原代大鼠皮膚成纖維細胞表現出肌成纖維細胞的形態特征（見圖1），胞質濃厚，細胞體積顯著變大。

2.2 低密度培養誘導成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞

皮膚增生性瘢痕形成實質是纖維化的形成過程。根據之前對肝臟纖維化的研究，觀察到了具有成纖維細胞特性的肝臟星狀細胞在體外發生轉分化的過程[15]。在此基礎上，為了進一步驗證低密度培養條件下的大鼠原代皮膚成纖維細胞能夠轉分化為肌成纖維細胞，利用實時熒光定量PCR和Western Blot檢測轉分化后肌成纖維細胞標志物alpha-平滑肌激動蛋白（α-SMA）的表達情況。結果表明，與高密度培養的成纖維細胞相比，低密度培養的成纖維細胞中α-SMA在轉錄水平和蛋白水平均顯著上調（見圖2），具有顯著性差異（P<0.05），表明低密度培養條件下的原代大鼠皮膚成纖維細胞具有肌成纖維細胞的特性，其標志物α-SMA顯著上調，與之前兔子角膜成纖維細胞中的研究報道相吻合[16]。

2.3 MMP-9和MMP-13在肌成纖維細胞中下調

皮膚增生性瘢痕是損傷修復后過度生長的瘢痕組織，其主要細胞成分是肌成纖維細胞。在皮膚損傷初期，基質金屬蛋白酶（MMPs）表達量急劇上調，但是隨著瘢痕的形成，MMP基因逐漸發生沉默。在此基礎上，再次構建兩種密度培養模型，模擬正常條件下的成纖維細胞（高密度培養）和慢性損傷后形成的肌成纖維細胞（低密度培養），通過半定量PCR證明肌成纖維細胞標志物α-SMA顯著上調（見圖3（a））。其次，在兩種密度培養條件下，分別設置10 ng/mL TNF-α處理組和空白對照組，24 h后通過實時熒光定量PCR檢測MMP-9和MMP-13的表達。結果表明，經TNF-α處理后，MMP-9的轉錄水平在高密度培養條件下，較對照組顯著上調（見圖3（b））；而在低密度培養條件下，加入TNF-α后，MMP-9的轉錄水平較對照組沒有顯著變化（見圖3（b））。與此同時，原代大鼠皮膚成纖維細胞在高密度培養條件下，經TNF-α處理后MMP-13的mRNA表達量較對照組顯著上調（見圖3（b））；而在低密度培養條件下，雖然TNF-α也能夠誘導MMP-13的mRNA表達上調，但上調程度低于高密度培養時（見圖3（b））。

隨后，利用明膠酶譜實驗對MMP-9的活性進行了檢測，結果表明，高密度培養條件下成纖維細胞經TNF-α刺激后，MMP-9的活性較空白對照組顯著上調（見圖3（c））；而在低密度培養條件下，經 TNF-α刺激后，MMP-9的活性并沒有顯著變化。此外，與高密度相比，低密度培養條件下TNF-α并不能誘導MMP-9的活性上升。隨后利用IPP軟件進行灰度掃描，統計MMP-9的相對光密度，結果與明膠酶譜完全一致（見圖3（c））。因此初步表明原代大鼠皮膚成纖維細胞在高密度培養條件下，TNF-α能夠誘導MMP-9和MMP-13發生顯著的上調且差異具有統計學意義（P<0.05，P<0.01）；在低密度培養條件下TNF-α不能誘導MMP-9和MMP-13發生顯著變化。

3 討 論

成纖維細胞（Fibroblast）是瘢痕形成的主要效應細胞，創傷發生后間充質細胞或靜止的纖維細胞轉分化為成纖維細胞，參與傷口修復[17]。本實驗利用大鼠原代皮膚成纖維細胞作為研究對象，通過構建高密度培養和低密度培養模型，分別模擬成纖維細胞的靜息狀態和激活狀態，初步解釋了成纖維細胞間的相互作用是誘導其轉分化為肌成纖維細胞的一個重要因素，但是否存在其他因素也可以誘導成纖維細胞轉分化，如培養基中的成分、血清中的生長因子以及成纖維細胞自分泌的其他細胞因子等還有待深入研究。有報道證明[18]，成纖維細胞在受到刺激后能夠大量分泌轉化生長因子-β（TGF-β），TGF-β又可以誘導成纖維細胞發生轉分化，促進纖維化的進程。

研究表明，具有持續增長活性的細胞，如骨髓細胞、腫瘤細胞，其基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達量通常非常高，具有促進細胞增殖、細胞遷移和細胞分化的功能[19-20]。在急性肝臟損傷和急性皮膚損傷初期，MMPs基因的表達量非常高，隨著傷口愈合、增生瘢痕的形成，MMPs基因逐漸發生沉默。Qin等[15]利用大鼠肝臟星狀細胞研究發現，MMP-9和MMP-13的沉默發生在表觀遺傳學水平，是由組蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）招募到MMP-9和MMP-13啟動子區域，抑制了MMP-9和MMP-13的轉錄活性。

在模型中，低密度培養下的皮膚成纖維細胞能夠自發的轉分化為肌成纖維細胞，并且在炎癥因子TNF-α的刺激下，與高密度培養相比MMP-9和MMP-13不再產生應答。在皮膚成纖維細胞中，MMP-9和MMP-13的沉默很可能是由HDAC4或該家族其他成員引起，HDACs通過去乙?；饔茫斐扇旧|濃縮，MMP基因的轉錄活性下調，無法降解胞外基質，最終促進皮膚纖維化的發展。此外，MMPs啟動子區的甲基化也可能是引起MMPs基因沉默的重要原因，甲基化造成染色質結構發生改變，轉錄因子AP-1無法招募到MMPs啟動子區，造成MMPs轉錄水平與蛋白水平下調，促進胞外基質堆積?；贛MPs的調控主要發生在轉錄水平和表觀遺傳學水平，因此可以通過染色質免疫共沉淀與高通量測序相結合的方法（ChIP-Seq），在全基因組水平檢測與MMPs基因啟動子相互作用的轉錄因子，篩選出可能調控MMPs基因沉默蛋白因子。

4 結束語

本文在體外初步探索了皮膚成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞的條件，并且測定了MMP-9和MMP-13的表達變化，為皮膚損傷和增生性瘢痕的發生和發展的研究提供了新的思路。

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（編輯：莫婕）