殼聚糖修飾脂質體對姜黃素的包載作用

嚴佳蕾 王小永

摘 要：通過改變殼聚糖的濃度探討不同濃度殼聚糖修飾的脂質體對姜黃素的包載作用。采用薄膜蒸發法制備姜黃素脂質體，并以不同濃度的殼聚糖對姜黃素脂質體進行修飾。通過測定修飾后的姜黃素脂質體的物理化學性質，探討不同濃度的殼聚糖對姜黃素脂質體的包封率以及姜黃素的穩定性、抗氧化性以及熒光、紫外光譜性質的影響。當殼聚糖質量分數由0增大到0.4%時，脂質體內姜黃素的穩定性以及DPPH自由基清除能力也不斷增大。當殼聚糖質量分數進一步增加到0.5%～0.7%時，姜黃素的穩定性與抗氧化能力逐漸減小。由此表明存在最佳的殼聚糖質量分數（0.4%），在此條件下殼聚糖修飾脂質體對姜黃素的保護作用最佳，姜黃素的穩定性、抗氧化能力最高。

關鍵詞：姜黃素；脂質體；殼聚糖；穩定性；抗氧化

文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2016）09-0061-06

0 引 言

姜黃素是從姜黃的根莖中提取的一種多酚類化合物，其抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化等多種藥理學性質逐漸受到國內外學者的重視[1]。盡管姜黃素在治療和預防人類疾病方面安全且高效，但姜黃素的水溶性較差、生物利用率低等缺點很大程度上限制了姜黃素在臨床醫學上的應用。針對姜黃素的性質以及存在的問題，最常見的方法是通過劑型改造提高姜黃素穩定性、水溶性進而提高姜黃素的生物利用率。脂質體是將藥物包封于類脂雙分子層形成的超微型球狀制劑，是一類水溶性良好的藥物載體。脂質體的膜材與細胞膜的組成成分極為類似，與機體的生物相容性非常好。作為藥物載體，脂質體具有載藥靶向運行、延長療效、降低不良反應等優點[2]，已經有多種脂質體用于臨床研究，具有廣闊的應用前景[3]。將殼聚糖與脂質體以及牛血清蛋白結合起來能夠制備出更穩定的載藥體系，用于包載姜黃素不僅能夠提高姜黃素的穩定性與生物利用度，同時可以降低姜黃素的用量，減少對其他部位的毒副作用，以便為其臨床應用提供更好的基礎。本文主要是在pH 6.5的條件下，研究不同質量分數殼聚糖（0.1%～0.7%）修飾的脂質體對姜黃素的包載作用。通過測定姜黃素脂質體的物理化學性質，探討殼聚糖對姜黃素的包封率、穩定性、抗氧化性、以及熒光、紫外光譜性質的影響。

1 實驗試劑與儀器

1.1 實驗試劑

姜黃素（m/m：70%，Sigma）；卵磷脂（來源于大豆，純度55%，Sigma）；殼聚糖（AR，Sigma）；膽固醇（m/m：99%，Sigma）；三氯甲烷（AR，上海化學試劑有限公司）；無水乙醇（AR，上海凌峰化學試劑有限公司）；無水甲醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，AR，Sigma）。

1.2 實驗儀器

分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；旋轉蒸發儀（上海申勝生物技術有限公司）；紫外可見分光光度計UV2450（日本島津公司）；熒光光譜儀FLS900（英國愛丁堡公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海科興儀器有限公司）；低溫恒溫槽（上海比朗儀器有限公司）；Nano ZS動態光散射儀（DLS）（英國馬爾文公司）；PHS-3C型數字pH計（上海偉業儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 配置pH 6.5的磷酸鹽緩沖溶液

分別稱取一定量Na2HPO4和NaH2PO4固體顆粒，加入重蒸水制得0.01mol/L的Na2HPO4溶液和0.01 mol/L的NaH2PO4溶液。將兩種磷酸鹽溶液以一定比例混合，并同時測定混合溶液的pH值，直到溶液的pH值為6.5。

2.2 配置不同質量分數殼聚糖溶液

分別稱取一定量低分子量殼聚糖溶解在1%鹽酸溶液中。由于殼聚糖溶液需要以1∶1的體積比與脂質體溶液混合進行修飾，因此配置的殼聚糖溶液質量分數分別為0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%（混合后的質量分數為0.1%～0.7%）。

2.3 姜黃素脂質體的制備

采用薄膜蒸發法制備姜黃素脂質體。首先利用電子天平按照質量比3∶1精確稱取一定量卵磷脂和膽固醇。將卵磷脂和膽固醇的混合物加入到體積比為2∶1的氯仿甲醇混合有機溶劑中，用玻璃棒攪拌使其充容溶解后轉移至茄型瓶。同時稱取一定姜黃素固體粉末，轉移至茄型燒瓶中使得姜黃素的物質量濃度為50 μmol/L。在43 ℃的水浴條件下利用旋轉蒸發儀將混合溶液旋蒸30 min，使其旋轉蒸發成膜直至混合溶劑完全蒸發。加入30 mL pH 6.5的磷酸鹽緩沖溶液并在磁力攪拌器上攪拌30 min使得瓶壁上的脂質體膜充分溶解在緩沖溶液中。最后60 ℃水浴條件下孵化60 min，最終得到所需姜黃素脂質體。

2.4 殼聚糖修飾的姜黃素脂質體的制備

將質量分數為0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%的殼聚糖溶液與姜黃素為50 μmol/L的姜黃素脂質體溶液等體積混合，得到實驗所需的7個樣品溶液，即質量分數為0.1%～0.7%殼聚糖修飾的姜黃素脂質體，溶液中姜黃素和磷脂的物質量濃度分別為25 μmol/L和280 μmol/L。

2.5 姜黃素包封率的測定

采取離心法測定姜黃素脂質體的包封率。量取姜黃素脂質體、0.1%～0.7%殼聚糖修飾的姜黃素脂質體溶液各3 mL置于離心管中， 14 000 r/min離心30 min，下層沉淀部分即制備的姜黃素脂質體。倒去含有游離姜黃素的上層溶液，用無水乙醇溶液溶解離心管底部的姜黃素脂質體。利用姜黃素在乙醇溶液中的標準曲線得到姜黃素脂質體中姜黃素的質量濃度。包封率的具體計算如下所示：

包封率=■×100%（1）

2.6 粒徑及Zeta電位的測定

使用Nano ZS動態光散射儀來測定姜黃素脂質體以及殼聚糖修飾后姜黃素脂質體的粒徑和Zeta電位。在測量之前，需將制備的待測樣品用pH 6.5的PBS溶液稀釋10倍。將儀器溫度設置到25 ℃后預熱30 min，溶液加入樣品池后放入儀器使樣品在25 ℃下恒溫5 min便可開始測量，每個樣品測量3次以降低誤差。

2.7 不同樣品中姜黃素穩定性的測定

取制備得到的姜黃素脂質體以及0.1%～0.7%殼聚糖修飾的姜黃素脂質體于燒瓶中，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液攪拌使其充分混合。利用紫外可見光譜儀測定不同樣品中的姜黃素在25 ℃、pH 7.4的正常光照條件下經過10，20，30，40，50，80，110，140，

200 min后在特征吸收峰425 nm處的吸光度變化，以反映姜黃素在溶液中降解的程度。

作為對照，同時測定了游離姜黃素在相同條件下靜置10，20，30，40，50，80，110，140，200 min后的降解情況，通過比較姜黃素的降解程度來說明脂質體和殼聚糖修飾的脂質體對姜黃素的保護作用。

2.8 姜黃素的紫外、熒光發射光譜的測定

使用紫外可見光譜儀和熒光發射光譜儀在25 ℃、pH 6.5的條件下測量游離姜黃素、姜黃素脂質體、0.1%～0.7%殼聚糖修飾的姜黃素脂質體在300～600 nm波長范圍內的紫外吸收光譜以及450～650 nm之間的熒光發射光譜。

2.9 姜黃素的DPPH清除率的測定

采用DPPH自由基清除的方法來測定不同樣品中姜黃素抗氧化能力。在25 ℃的條件下，取游離姜黃素、姜黃素脂質體及殼聚糖修飾后的姜黃素脂質體分別與0.015 mol/L的DPPH溶液在棕色瓶內均勻混合，靜置20 min后開始測量DPPH在517 nm處紫外強度的變化。通過下式來計算不同樣品中姜黃素的DPPH自由基清除率：

DPPH Scavenging Capacity=（1-■）×100%

（2）

式中：Ablank——姜黃素樣品和乙醇的混合溶液在517 nm處的紫外吸光度；

Asample——DPPH和姜黃素樣品混合溶液反應20 min后在517 nm處的紫外吸光度；

Acontrol——DPPH和重蒸水混合溶液在517 nm處的紫外吸光度。

3 結果與討論

3.1 姜黃素標準曲線的測定

配置質量濃度分別為0.75，1.50，2.25，3.00，3.75，

4.50，5.25 mg/L的姜黃素乙醇溶液，測定其在425 nm處吸光度的數值從而得到表示姜黃素吸光度（A）與質量濃度（Ccurcumin）關系的標準曲線，如圖1所示。通過擬合實驗數據得到直線方程：

A=0.134 2Ccurcumin+0.061 4（r=0.998 7）（3）

3.2 姜黃素包封率的測定

姜黃素脂質體、0.1%～0.7%殼聚糖修飾的姜黃素脂質體的包封率數據見表1。

在實驗溫度為25 ℃、pH 6.5的條件下，姜黃素脂質體樣品中姜黃素的包封率為80.1%，遠高于Takahashi等[4]研究得出的姜黃素包封率。導致包封率與文獻報道值不同的原因可能是制備脂質體膜材料來源以及姜黃素脂質體所處環境的pH值不同。在不同pH條件下姜黃素脂質體內姜黃素的降解機理和動力學過程都已被充分研究，Wang等[5]研究表明在pH 7.2的條件下，90%的姜黃素會在30 min降解完畢；而當pH為6.5時，超過97%的姜黃素都能夠在溶液中穩定存在。因此本次實驗條件的pH 6.5是促使姜黃素包封率高于文獻值最重要的原因之一。用0.1%～0.7%殼聚糖修飾過的姜黃素脂質體的姜黃素包封率分別為：82.4%，83.4%，84.5%，85.3，85.0%，83.7%，82.0%，由此推斷殼聚糖在姜黃素脂質體的外層形成了一圈“保護層”，使得在制備、反應以及實驗過程中姜黃素脂質體的結構得到了更好的保護，避免了姜黃素從脂質體內轉移到溶劑當中。當殼聚糖為0.4%時姜黃素的包封率最高，隨著質量分數繼續增大，姜黃素的包封率逐漸遞減。由此可以推斷利用殼聚糖修飾姜黃素脂質體時，當殼聚糖的濃度超過一定范圍時，會促使脂質體結構穩定性降低，從而使得姜黃素從脂質體內泄露。

3.3 姜黃素脂質體的粒徑及Zeta電位的測定

姜黃素脂質體、0.1%～0.7%殼聚糖修飾的姜黃素脂質體的粒徑見表2。

當殼聚糖的質量分數在0.1%～0.4%的時，粒徑隨著其增大而逐漸減小。由此現象推測得到當用濃度較小的殼聚糖溶液修飾姜黃素脂質體時，殼聚糖通過靜電作用在脂質體外層形成“保護層”較為松散。隨著殼聚糖濃度的不斷增大，殼聚糖在脂質體外的排列逐漸緊密，因此當質量分數為0.4%時體系的平均粒徑最小。繼續增加到0.7%時，脂質體粒徑反而逐漸增大，由此推測得到當溶液中殼聚糖濃度過大，過多的沒有吸附到脂質體上的殼聚糖會引起體系的混亂度增大、脂質體之間發生聚集從而導致脂質體的平均粒徑逐漸變大。

姜黃素脂質體、0.1%～0.7%殼聚糖修飾的姜黃素脂質體的Zeta電位如表3所示。當Zeta電位的數值在±30～±60 mV這個范圍內就可以推測該體系具有良好的穩定性。本次實驗中姜黃素脂質體的Zeta電位是-32.6 mV，較大的排斥力使得姜黃素脂質體體系具有較好的穩定性。帶正電的殼聚糖是通過靜電作用與帶負電的脂質體相結合[6]，當加入殼聚糖對姜黃素脂質體進行修飾后發現體系的Zeta電位由-32.6 mV變成了45.1 mV，這說明殼聚糖已經通過靜電作用吸附到姜黃素脂質體的表面。當殼聚糖由0.1%增加到0.2%時發現體系的Zeta電位增大了4 mV，結合粒徑結論推測當殼聚糖濃度還較低時，隨其增大會有更多的殼聚糖通過靜電力與脂質體表面發生結合，從而導致體系的Zeta電位的增大。當殼聚糖質量分數為0.2%～0.7%時，體系的Zeta電位趨于恒定值，表明帶正電的殼聚糖與帶負電的脂質體之間的吸附作用達到飽和。

3.4 姜黃素的穩定性

表4和圖2是游離姜黃素、姜黃素脂質體以及0.1%～0.7%殼聚糖修飾的姜黃素脂質體中姜黃素在200 min內的降解率以及姜黃素的降解曲線。由實驗結果可見在200 min后游離的姜黃素降解了40.6%，當采用脂質體對姜黃素進行包載后，姜黃素的降解率減少至22.1%，表明脂質體對姜黃素起到了很好的保護作用，在很大程度上提高了姜黃素的穩定性。有學者探討了游離姜黃素以及姜黃素脂質體中姜黃素的降解情況，研究結果表明姜黃素的降解是一級動力學反應[5]。通過計算得出游離姜黃素的的一級降解速率常數是0.002 5 min-1，姜黃素脂質體中姜黃素的一級降解速率常數是0.001 2 min-1。前者是后者降解速率的2.1倍，由此表明脂質體可以很大程度上保護姜黃素，減緩姜黃素在人體中的降解。人體內的pH值為7.4，在此條件下姜黃素極易發生降解，是因為姜黃素分子中的二酮脂肪鏈的活性碳原子上的質子丟失，導致共軛雙烯結構的破壞[7]。當用脂質體包載姜黃素后，姜黃素分子的苯氧基介于脂質體與溶液的交界面；與此同時烯醇基團和另外一個苯氧基團在脂質體的疏水核內部，烯醇式鑲嵌到磷脂雙分子層內從而提高了姜黃素的穩定性[8]。由于脂質體膜有一定的通透性，因此包封的藥物在經過一定時間的放置后容易泄露到膜外[9]。當進一步用不同濃度的殼聚糖修飾姜黃素脂質體后姜黃素的降解率有了進一步的減小，說明水溶性的殼聚糖通過靜電作用在脂質體表面形成了一層致密的親水保護層，降低了脂質體膜的流動性，避免了包載的姜黃素從脂質體內向外滲漏。但隨著殼聚糖質量分數的增加，溶液的粘度也會逐漸增加。由于大分子間摩擦力、纏繞情況的增加使得殼聚糖溶液流動困難[10]。因此當殼聚糖的質量分數超過0.4%時，整個體系的濃度變大，導致脂質體之間容易發生絮凝、沉降。同時由于殼聚糖大分子之間摩擦力的增強會導致脂質體結構的穩定性降低，脂質體發生破裂從而使得包載在內的姜黃素滲漏到溶液中。

3.5 姜黃素的紫外可見吸收光譜、熒光發射光譜的測定

游離姜黃素、姜黃素脂質體、0.1%～0.7%殼聚糖修飾的姜黃素脂質體的粒徑以及姜黃素脂質體的紫外光譜圖、熒光光譜圖見圖3、圖4。由圖3可知游離姜黃素在427 nm處有最大吸收峰，在360 nm處存在一個肩峰[11]。而姜黃素脂質體中的姜黃素在424 nm處有最大吸收峰，在445 nm處有一個吸收肩峰。游離姜黃素在360 nm處存在肩峰是因為在水溶液中存在少量去質子化的姜黃素離子。當姜黃素被包載到脂質體中后，360 nm處的肩峰消失，這個現象說明磷脂雙分子層與姜黃素之間的相互作用避免了姜黃素在溶液中去質子化形成姜黃素離子。當姜黃素所處環境的極性減小時，π-π*躍遷的吸收峰藍移，n-π*躍遷的吸收峰發生紅移，姜黃素的紫外吸光度增強[12]。因此，當樣品中姜黃素的濃度一定時，包載在脂質體內的姜黃素的紫外吸收強度比游離姜黃素的紫外吸收強度要大。同時還研究了不同體系中的姜黃素在25 ℃，pH 6.5條件下的熒光發射光譜，由圖4可知游離姜黃素的熒光強度十分低，其原因是游離姜黃素處于一個溶液極性較大的環境，在575 nm處的熒光發射強度十分低。當姜黃素處于脂質體磷脂雙分子層中時，由于所處環境的極性減小，因此姜黃素的熒光發射強度明顯增大，并且最大發射峰的位置發生了藍移，這與紫外的實驗結論相吻合。

由圖3、圖4可知，當用不同濃度的殼聚糖對姜黃素脂質體進行修飾后，樣品體系中姜黃素的紫外吸收強度以及熒光發射強度都有了相應的增強。由于在制備過程中保證所有樣品中姜黃素的原始濃度恒定，因此促使姜黃素紫外吸收值和熒光發射強度增大的原因可能是在0.1%～0.4%的質量分數范圍內，殼聚糖的修飾使更多的姜黃素與磷脂雙分子層結合，脂質體的結構更加穩定從而使得姜黃素得到了更好的保護。但是，當殼聚糖超過0.5%后，正如前述體系的穩定性因殼聚糖粘度增大、流動性差而降低，使得脂質體發生破裂，而姜黃素從極性低的磷脂雙分子層中滲透到極性較大的緩沖溶液中[13]。

3.6 姜黃素DPPH清除率的測定

由圖5可以看到在pH 6.5的緩沖溶液中，游離姜黃素的DPPH自由基清除率僅有21.6%。曾有文獻報道在有機溶劑中游離姜黃素對DPPH自由基的清除率超過50%[14]，造成如此大差異可能是由于姜黃素所在環境的極性不同。姜黃素脂質體對DPPH的清除率大于40%，這表明有更多的DPPH自由基獲得了脂質體內姜黃素所貢獻的氫原子[15]。當姜黃素位于疏水的磷脂雙分子層間時，會有更多的疏水性的DPPH分子與姜黃素發生反應，獲得姜黃素給出的氫質子。文中，DPPH自由基清除率的高低首先取決于不同樣品中姜黃素的包封率。而且當殼聚糖質量分數為0.1%～0.4%時，殼聚糖的修飾為姜黃素與DPPH自由基之間的反應創造了更加理想的微環境條件。當殼聚糖質量分數超過0.5%后，由于脂質體結構的穩定性降低從而導致更多姜黃素還未來得及給出氫原子就泄露到緩沖溶液中或發生降解。因此當殼聚糖質量分數在0.5%～0.7%時，姜黃素對DPPH自由基的清除能力也有了相應的減小。

4 結束語

本文旨在研究不同質量分數殼聚糖修飾脂質體對姜黃素的包載作用。采用薄膜蒸發法制備姜黃素脂質體，然后將姜黃素脂質體與不同質量分數的殼聚糖（0.1%～0.7%）按照1∶1的體積比進行混合。通過研究得知殼聚糖修飾的脂質體對姜黃素有較強的保護作用，能提高姜黃素的穩定性以及抗氧化能力。隨著殼聚糖質量分數的增大，存在最佳的殼聚糖修飾質量分數（0.4%）使得殼聚糖修飾脂質體對姜黃素的保護作用最強，在此最佳條件下姜黃素的穩定性、抗氧化能力最高。當殼聚糖濃度太大時會導致姜黃素脂質體體系產生絮凝、沉降，降低體系的穩定性以及對姜黃素的保護作用，從而導致姜黃素的穩定性及抗氧化能力的降低。

參考文獻

[1] 楊永安，張凱，唐紅軍，等. 水環境中揮發性有機物的監測方法[J]. 四川環境，2014，33（3）：108-112.

[2] LIAN T， HO R J. Trends and developments in liposome drug delivery systems[J]. J Pharm Sci，2001，90（6）：667-680.

[3] CARTEL L， CERUTI M， DOSIO F. From conventional to stealth liposomes： a new frontier in cancer chemotherapy[J]. Tumor，2003，89（3）：237-249.

[4] TAKAHASHI M， UECHI S， TAKARA K， et al. Evaluation of an oral carrier system in rats： bioavailability and antioxidant properties of liposome-encapsulated curcumin[J]. J Agr Food Chem，2009（57）：9141-9146.

[5] WANG Y J， PAN M H， CHENG A L， et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis，1997，15（12）：1867-1876.

[6] LI L， ZHANG Y， HAN S， et al. Penetration enhancement of lidocaine hydrochlorid by a novel chitosan coated elastic liposome for transdermal drug delivery[J]. J Biomed Nanotechnol，2011（7）：704-713.

[7] JOVANOVIC S V， STEENKEN S， BOONE C W， et al. H-atom transfer is a preferred antioxidant mechanism of curcumin[J]. Journal of the American Chemical Society，1999（121）：9677-9681.

[8] BARRY J， FRITZ M， BRENDER J R， et al. Determining the effects of lipophilic drugs on membrane structure by solid-state NMR spectroscopy： The case of the antioxidant curcumin[J]. Journal of the American Chemical Society，2009（131）：4490-4498.

[9] 吳斌. 水溶性殼聚糖修飾甘草酸脂質體的制備及其釋藥性能的研究[D]. 武漢：武漢理工大學，2009.

[10] 陳雄. 殼聚糖溶液行為研究[D]. 北京：北京服裝學院，2008.

[11] WANG F， YANG J， WU X， et al. Investigation of the interaction between curcumin and nucleic acids in the presence of CTAB[J]. Spectrochim Acta，2007（67）：385-390.

[12] WANG F， WU X， WANG F， et al. The sensitive fluo

rimetric method for the determination of curcumin using the enhancement of mixed micelle[J]. J Fluoresc，2006（16）：53-59.

[13] TAN C， XUE J， KARANGWA E， et al. Dual effects of chitosan decoration on the liposomal membrane physicochemical properties as affected by chitosan concentration and molecular conformation[J]. J Agr Food Chem，2013（61）：6901-6910.

[14] PRIYADARSINI K I， MAITY D K， NAIK G H， et al. Role of phenolic O-H and methylene hydrogen on the free radical reactions and antioxidant activity of curcumin，Free Radical Bio[J]. Med，2003（35）：475-485.

[15] KIM K W， THOMAS R L. Antioxidative activity of chitosans with varying molecular weights[J]. Food Chemistry，2007，101（1）：308-313.

（編輯：莫婕）