快速檢測農藥殘留技術的應用現狀

馮俊宸,徐華能（.上海外國語大學附屬外國語學校，上海 00083；.上海市農藥研究所，上海 0003）

快速檢測農藥殘留技術的應用現狀

馮俊宸1,徐華能2
（1.上海外國語大學附屬外國語學校，上海 200083；2.上海市農藥研究所，上海 200032）

主要綜述了目前廣泛應用的農藥殘留檢測技術酶抑制檢測法、酶聯免疫檢測法、活體生物測定法、生物傳感器法等快速測定方法的原理、優缺點。

農藥殘留；酶抑制；酶聯免疫；活體生物測定；生物傳感器；

農藥在農業生產中的地位和作用不容置疑。如不使用農藥，農作物的產量將減少1/3。但是由于部分使用者未規范、正確使用農藥（如超范圍或超劑量使用等），導致農產品中的農藥品種及殘留量超出安全標準，給食品帶來了很大的安全隱患。當前我國政府正在不斷加強食品安全（尤其是農產品的食品安全）保障工作，對農產品中的農藥殘留進行規范監測就是其中一項重要的措施。為此，農藥殘留檢測技術的改進，檢測技術的靈敏度和準確率的提高以及對快速檢測分析新技術的開發與建立，已經顯得日益迫切和十分重要。直接檢測農藥分子的常規農藥殘留分析方法，存在著樣品前處理復雜，儀器設備昂貴，分析時間長等問題。這些方法已不能滿足諸如大型農產品批發市場、超市等現場快速檢測某些高毒農藥的需求，促使人們運用新的原理和方法去開發特異性強、靈敏度高、方便快捷、結果確定的快速檢測新技術。本文主要綜述了目前廣泛應用的酶聯免疫分析方法、酶抑制法、活體生物測定方法和生物傳感器法等快速測定方法的應用現狀［1］。

1 酶聯免疫分析法（ELISA）

1.1 原理

ELISA的核心技術是抗原抗體的特異性反應。ELISA的基本原理是將抗原抗體之間的特異性免疫反應和酶對底物的高度催化效應結合起來，以酶促反應的放大作用來顯示初級免疫反應。它既可測抗原，也可測抗體［2］。

1.2 方法

EUSA需要固相載體作為吸附劑，用固相載體吸附抗體（抗原），加待測抗原（抗體），再與相應酶標記抗體（抗原）進行抗原抗體特異免疫反應，生成抗體（抗原）-待測抗原（抗體）-酶標記抗體（抗原）復合物，最后再與該酶底物發生反應生成有色產物。待測抗原（抗體）的量與有色產物量成正比，因此可借吸光度值計算抗原（抗體）量。ELISA法既可進行定性測定，又可進行定量測定。在上述反應中，酶促反應只進行一次，而抗原一抗體免疫反應可進行一次或數次［3］。

1.3 應用

ELISA技術還可應用于食品中其他成分的測定，⑴ 抗營養素因子如大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制因子；⑵ 食品營養成分如牛初乳中乳鐵蛋白含量等；⑶ 食品加工過程中的酶的含量變化；⑷ 檢測某些特定的轉基因表達蛋白，以分析食品是否來自轉基因生物或者含有轉基因成分［4］。

1.4 影響因素

影響因素一般涉及到樣本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結果判斷、結果報告和解釋等方面［5］。

1.5 前景

免疫分析法以其固有的優勢，在農藥殘留分析中日益顯示出強大的應用前景。其中以EUSA技術最活躍，EUSA具有特異性強、靈敏度高、快速、簡便、痕量檢測，以及可大批量樣本檢測的優點，其檢測限可達到納克甚至更低濃度。到現在為止，國際上已有上百種農藥可用免疫分析法檢測，且已制成商品化快速檢測試劑盒或試劑條。目前我國已研制出6種農藥殘留酶聯免疫檢測試劑盒（甲霜靈、甲胺磷、毒死蜱、對硫磷、2,4-滴、百菌清），膠體金免疫快速檢測試紙16種（3,5,6一三氯二吡啶醇、苯菌靈、除草定、丁草胺、毒死蜱、禾草靈、甲草胺、甲萘威、甲霜靈、霜霉威、西瑪津、溴苯腈、乙草胺、異丙草胺、異丙甲草胺、莠去津）。另外研制出高效快速檢測生物毒素的免疫檢測試劑盒13種和免疫膠體金紙條5種；研制出獸藥殘留酶聯免疫檢測試劑盒11種，其中有些試劑盒已實現產業化，取得了顯著的經濟效益和社會效益。與國外相比，國內在這方面的研究相對較少，但正越來越受到研究檢測工作者的高度重視。目前研發各種農藥殘留檢測試劑盒的步伐日益加快，所以ELISA法在農藥殘留檢測中將有廣闊的應用前景［6］。

抗體特異性及靈敏性雖有較大程度提高，但仍不能同時檢測數10種甚至更多農藥殘留。用于食品農藥殘留檢測，在檢測單個農藥時具有快速、方便等優點。但由于農藥品種繁多及混配使用等原因，在檢測大批樣品時，仍顯得無能為力［6］。

2 酶抑制法

酶抑制法是一種簡便、靈敏、經濟的快速檢測方法，是相對成熟的一種速測部分農藥殘留技術。它基于有機磷農藥對酶活性的抑制作用，適用于有機磷和氨基甲酸酯類農藥。在目前條件下，酶抑制法是凈化蔬菜市場的一種有效可行的方法，其優點是能對抑制膽堿酯酶的農藥品種進行快速靈敏的檢測，樣品前處理簡單，檢測時間短，所需儀器設備簡單，適用于現場測定。缺點是使用的酶基質和顯色劑有一定的特異性，需控制的條件較多［2］。

2.1 影響因素

2.1.1 溫度和pH對酶促反應的影響

酶的活性都隨著溫度的升高先升高后降低［5］。

2.1.2 時間對酶促反應的影響［5］

隨反應時間延長，反應速度下降。酶的反應時間應該在初速度時間范圍內選擇。

2.1.3 溫度對農藥抑制作用的影響

在一定的溫度范圍內（25～45 ℃）植物酯酶和乙酰膽堿酯酶受到農藥的抑制作用都是隨著溫度的升高而增強［5］。

2.2.4 時間對農藥抑制作用的影響

抑制時間越長，農藥的抑制作用越強［5］。

2.2 分類

酶抑制法根據所使用的酶的種類不同可大致分為2類：膽堿酯酶法和植物酯酶法。

2.2.1 膽堿酯酶法

2.2.1.1 原理

乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制法的檢測原理以乙酰膽堿為底物，在AChE的作用下，乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，膽堿和二硫對硝基苯甲酸（DTNB）產生顯色反應，使反應液呈黃色［2］。

2.2.1.2 特點

該法操作簡單，測定所需的時間短，不需要貴重的儀器，費用較低，適合于現場的快速檢測。AChE抑制法雖然在回收率和精密度上較經典方法差一些，但可以滿足半定量的要求，適合于我國小規模分散式的農產品生產與經銷體系。另外，各種農藥因其化學結構和作用機理不同對AChE的抑制能力也不相同，氧化型有機磷的抑制能力較強，AChE抑制法對其的靈敏度較高，最小檢出濃度較低；而硫代型有機磷的抑制能力較差，最小檢出濃度較高；但辛硫磷因為含有肟基，選擇毒力大大增強，最小檢出濃度較低；對氨基甲酸酯類農藥的檢測靈敏度相對都較高［4］。

2.2.2 植物酶抑制法

2.2.2.1 原理

植物酯酶水解2,6-二氯乙酰靛酚，水解產物靛酚為藍色，最大吸收波長為605 nm。根據反應溶液在水解前后顏色的變化，用目測或儀器來判定農藥對酶的抑制程度，從而判斷有機磷或氨基甲酸酯類農藥的殘留量［2］。

2.2.2.2 特點

在利用酶抑制原理測定農藥殘留的方法中，植物酯酶與動物酯酶相比，抑制程度的各項指標均不遜色很多，同時又具有酶源方便易得，提取、保存方便，成本低等優勢。但是目前的研究表明植物酯酶方法的精確度和靈敏度不及乙酰膽堿酯酶法，乙酰膽堿酯酶法的檢出限數量級在0.001 mg/kg附近，而植物酯酶法只能在0.1 mg/kg附近，靈敏度較低［4］。

3 活體生物測定

3.1 原理

活體檢測法是使用活的生物體直接測定。如農藥與細菌作用后可影響細菌的發光強度，以檢測農藥殘留量［2］。

3.2 方法

3.2.1 用發光細菌檢測農藥殘留

發光細菌體內的熒光素在有氧時經熒光酶的作用會產生熒光，但當受到某些有毒化合物的作用時光會減弱，其減弱的程度與有毒物的濃度呈一定的線性關系。利用這一特點對農藥殘留試樣進行測定。該方法的特點是快速、簡便、靈敏、價廉，適合于現場，缺點是農藥濃度與發光強度的線性關系不夠準確，只能用于半定量測定［3］。

3.2.2 用家蠅檢測蔬菜中的殘留農藥

以采收前1～2 d的蔬菜為檢測對象，隨機抽取檢測樣品，將家蠅放于菜汁中，接觸后3～4 h觀察死亡率，并且需要用無農藥污染的蔬菜作為對照。死亡率在4%以下為安全或較安全；死亡率為5%～10%，蔬菜中農藥殘留量超標；死亡率大于11%，表示污染嚴重或極嚴重。該方法的優點是無需儀器，無需前處理，過程簡單。缺點是無法定量，檢測時間比較長，敏感性家蠅飼養比較困難［3］。

4 生物傳感器法

生物傳感器是將傳感技術與農藥免疫技術相結合而建立起來的，可以說它是免疫分析技術的一種延伸或分支。根據生物功能不同主要分為不同類型傳感器，利用農藥對靶酶活性的抑制作用研制傳感器時，應選擇活性高而其活性對農藥敏感的酶作為生物傳感器稱為酶傳感；利用農藥與特異性抗體結合特性研制免疫傳感器；另外還有微生物傳感器和組織傳感器等［3］。

4.1 原理

生物敏感膜內含有能與目標物進行選擇性作用的生物活性組分；換能器則能敏感捕捉生物活性組分與目標物之間的作用過程，并將其表達為可檢測的物理信號。當待測物與具有分子識別作用的利用特殊技術固定在換能器內（或表面）的生物活性因子作用時，產生光學、熱學、壓電學或電化學等響應信號，最后把所得的電信號經過電子技術的處理后，在儀器上顯示或記錄下來，其信號大小與分析物含量或濃度存在定量關系，從而實現對待測物質的定量檢測［2］。

4.2 應用

Ngeh-Ngwainbi等最早研究成功了對硫磷的生物傳感器，以后又有人制成了光導纖維免疫傳感器，利用熒光標記抗體產生的反應，分析測定對硫磷在溶液中含量。生物傳感器能廣泛應用于基礎研究、生物、臨床化學和診斷、農業和畜牧獸醫、化學分析、軍事、過程控制與監測、環境監控與保護等領域。隨著生物、化學、物理學、醫學、電子技術等相關學科的迅速發展，生物傳感器的發展也被帶動，各種類型的生物傳感器相繼出現［4］。

生物傳感器相對于酶免疫吸附測定法的優點是簡單、快速且減少了樣品的前處理。適于野外快速監測，減少有機溶劑使用量。雖然生物傳感器在實驗室條件下使用狀態良好，但在實際中還沒有廣泛應用，其最大優點是穩定性、精確度和可信度高。它的缺點是一種傳感器只能對應一種或一類農藥，應用范圍窄，研究過程長，不易制備［4］。

生物傳感器是一門跨學科的高新技術，起步較晚，研制過程有諸多難點，在實際推廣應用中還有許多待探索和改進的地方。⑴ 生物傳感器壽命、穩定性及制備的復雜性制約著研究成果商品化與批量生產；⑵ 穩定性：由于生物單元的引入，生物結構固有的不穩定、易變性給生物傳感器的應用帶來不少困難［6］。

［1］曾小嵐, 張歆, 付東亮, 等. 酶抑制法檢測蔬菜中的有機磷農藥［J］.環境監測管理與技術, 2004, 16（6）:12-14.

［2］邱靜. 我國主要農藥殘留快速檢測方法及產品現狀分析［J］. 農產品質量與安全, 2011（5）: 41-46.

［3］謝艷姣, 吳榮順, 苑婷婷. 農藥殘留快速檢測技術研究進展［J］. 中國果菜, 2015（12）: 31-34.

［4］鄧敏姬, 鄧敏航, 鄭琪, 等. 農藥殘留快速檢測技術研究進展［J］. 廣西熱帶農業, 2010（5）: 7-11.

［5］楊靚, 劉小娟, 郭玉雙. 農藥殘留快速檢測技術研究進展［J］. 黑龍江農業科學, 2012（10）: 150-153.

［6］王亮, 潘琇, 徐婉莉, 等.食品農藥殘留快速檢測技術研究進展［J］.溫州農業科技, 2005（10）: 10-12.

Research of Rapid Detection of Pesticide Residue Technology

FENG Jun-cheng, XU Hua-neng
（1.Shanghai Foreign Language School Affiliated SISU, Shanghai 200083, China; 2.Shanghai Pestcide Research Institute, Shanghai 200032, China）

The detection techniques of the pesticide residues currently widely used are the enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme inhibition assay, in vivo bioassay and biological sensors. The paper introduces the principles, advantages and weaknesses and progress of those rapid determination methods.

pesticide residues; enzyme-linked immunosorbent assay; enzyme inhibitor; vivo bioassay; biological sensors

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2016.02.07

TQ450

A

1009-6485（2016）02-026-04

馮俊宸（1999—），男，上海人，參與開發了“Pesticide Kille”農殘快速檢測試劑盒，取得SAGE 2015中國區第3名。

徐華能（1979—），男，上海人，高級工程師，主要從事農藥標準物質的研制工作。E-mail: xuhuaneng@cnshspl.com。

2016-03-20。