二氫楊梅素體外抗氧化活性研究

王恩花，楊禮壽，逯鳳肖，秦　湉，秦澤華，郁建平

(貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025)

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二氫楊梅素體外抗氧化活性研究

王恩花，楊禮壽，逯鳳肖，秦湉，秦澤華，郁建平*

(貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025)

二氫楊梅素；體外抗氧化活性；自由基；總抗氧化活性

二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DMY)為藤茶的主要功效成分，又名蛇葡萄素、白蘞素、福建茶素等[1]。DMY 屬于黃酮類化合物，研究表明其毒性小，有優良的抑菌、護肝和抗癌等作用，可清除氧自由基，抑制自由基對人體組織器官的損害，具有很大的開發應用前景[2]。由于一些合成抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)被發現有不同程度的致癌等毒副作用，因而在美國和日本已停止使用[3]。隨著天然食品添加劑的開發，開發抗氧化活性好、毒性小的天然食品添加劑已成為研究熱點。有研究發現葡萄科蛇葡萄屬植物中大量存在DMY，且在顯齒蛇葡萄中其含量極高，這使得DMY開發為食品抗氧化劑成為可能[4]。本研究采用改良的DPPH對照法測定DMY對DPPH的體外清除率，羥自由基、超氧陰離子體外清除能力、體外總抗氧化能力則是采用快速簡便、穩定性好、再現性好的試劑盒方法進行測定。測定四個抗氧化性指標，較全面地對DMY進行抗氧化功能評價，為DMY在食品方面的開發應用提供進一步的參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

由貴州大學生化營養研究所植化實驗室提取的二氫楊梅素(DMY)。

1.2試劑

冰乙酸、無水乙醇、抗壞血酸(Vc)硫酸亞鐵，水楊酸，griess試劑，gress氏試劑，氫氧化鈉，三氯化鐵，過氧化氫，菲啉試劑均為國產分析純。特丁基對苯二酚(TBHQ)購買于河南千志商貿有限公司；對二苯基苦基肼自由基(DPPH)購買于阿拉丁；羥自由基測試盒、抗超氧陰離子測試盒、總抗氧化能力(T-AOC)測試盒購買于南京建成生物工程研究所。

1.3儀器與設備

ISO9001型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)，數顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)，KX-1740QTD型超聲波清洗儀(北京科璽世紀科技有限公司)，TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，GZE-9140 mBE型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博訊實業有限醫療設備廠)，XK96-A型快速漩渦混勻器(江蘇新康醫療器械有限公司)等。

1.4對 DPPH· 的清除測定

二苯代苦味肼基自由基(DPPH)能穩定存在于機溶劑中，不溶于水，在乙醇溶液中呈典型的紫色，并在517 nm處有最大吸收[5]。加入抗氧化劑時，抗氧化劑一個電子與DPPH分子中穩定的自由基配對，溶液的顏色由深紫色向黃色轉變，其褪色程度與抗氧化劑清除自由基的能力有關。由于DPPH 檢測法具有簡便易行、靈敏可靠、不需要昂貴的儀器設備等優點而廣泛應用于自由基清除劑的篩選和研究工作中[6]。

DPPH 溶液的配制：稱取 DPPH 0.0201 g于100 mL燒杯中，加10 mL無水乙醇，超聲5 min，轉移至250 mL容量瓶，定容，得到摩爾濃度為0.2039 mmol/L，避光保存，3 h 之內用完。

取2.0 mL濃度分別為5.0、7.5、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 mg/mL的DMY溶液和TBHQ溶液放置于試管中，各加入2.0 mL濃度為0.2039 mmol/L 的DPPH 溶液，在25℃水浴中避光反應30 min，用分光光度計在517 nm下測定吸光度值(A1)；取2.0 mL不同和濃度的溶液加入2.0 mL的無水乙醇，測定樣品吸光度(A2)；取2.0 mL蒸餾水加入2.0 mL DPPH溶液測得空白吸光度(A3)。以濃度分別為5.0、7.5、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 mg/mL 的Vc溶液為陽性對照。DPPH 清除率越高其抗氧化能力越強。

清除能力公式為：清除率(%)=[1-(A1- A2)/ A3]×100%

1.5對·OH的清除測定

生命代謝過程中會不斷產生活性氧，羥基自由基為最活躍的活性氧，是高反應自由基，毒害大，能夠激發油脂過氧化反應，因此在植物抗氧化性能力檢測時有必要對羥基自由基清除能力進行檢測[7-8]。羥基自由基檢測法原理是H2O2和Fe2 +混合后，生成具有很高反應活性、能與水楊酸結合產生顏色，在550 nm處有強吸收，羥基自由基清除物質可與水楊酸競爭，從而使得有色物質減少，通過比色法測定待測物的清除能力[9]。具體操作按照試劑盒說明進行。

取濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的DMY溶液和TBHQ溶液按說明書制備反應體系(見表1)，混勻，放置20 min，波長550 nm，測定各管吸光度值。以濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的Vc溶液為陽性對照，平行測定三次，取平均值。

表1　清除羥自由基反應體系

注：抑制羥自由基能力的計算：抑制羥自由基能力(U/mL)=(對照OD值-測定OD值)÷(標準OD值-空白OD值)×44.12

反應體系產生超氧陰離子自由基，加入電子傳遞物質及gress氏顯色劑，使反應體系呈紫紅色，體系含有超氧陰離子自由基抑制劑時，比色時測定管的吸光度低于對照管的吸光度。具體操作按照試劑盒說明進行。

分別取濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的DMY溶液和TBHQ溶液按試劑盒說明書制備反應體系(見表2)，混勻，放置10 min，550 nm波長處測定各管吸光度值。以濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的Vc溶液為陽性對照，平行測定三次，取平均值。

表2　抗超氧陰離子自由基反應體系

注：抗超氧陰離子活力計算：抗超氧陰離子活力單位(U/L)=(對照OD值-測定OD值)/(對照OD值-標準OD值)×150

1.7總抗氧化能力測定

體系中的抗氧化物質，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉試劑形成穩定的絡合物，通過比色可測出其抗氧化能力的高低。具體操作按照試劑盒說明進行。

取濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的 DMY溶液和TBHQ溶液按說明書制備反應體系(見表3)，混勻，放置10 min，520 nm波長下測定各管吸光度值。以濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的VC溶液為陽性對照，平行測定三次，取平均值。注意每個濃度都要測對照管。

表3　總抗氧化能力反應體系

注：總抗氧化能力計算公式：總抗氧化能力(單位/毫升溶液)=(測定OD值-對照OD值)÷0.3×37

2　結果與討論

2.1對 DPPH 自由基的清除能力

不同Vc、DMY 和TBHQ濃度對DPPH清除能力的影響，見表4和圖1。

從圖1可以看出，DMY、TBHQ在5～20 mg/mL試驗濃度范圍內時，其對DPPH的清除能力與濃度呈正相關，當Vc、DMY、TBHQ濃度為20 mg/mL 時，清除率分別為76.91%、91.79%、90.74%，DMY組與Vc組對自由基清除率具有極顯著差異(P< 0.01)，再增加DMY、TBHQ的含量對自由基清除率增大不明顯；常用抗氧劑VC對DPPH的清除作用隨Vc 濃度(5～30 mg/ mL)的增加而增大，當含量達到30 mg/mL 時，清除率為95.25%，再增加Vc的含量對自由基清除率增大不明顯。結果表明，DMY表現出較強的DPPH清除能力，濃度為20 mg/mL 清除率(91.79%)達最大值，與同濃度下Vc清除率(76.91%)有極顯著差異(P< 0.01)；當試驗濃度為30 mg/mL 時，DMY組清除率大最大值為94.25%，Vc組也達最大清除率95.25%，兩組沒有顯著性差異(P> 0.05),濃度再增加清除率變化不明顯。由此可見，當試驗濃度較低(5～20 mg/mL)時，DMY對清除DPPH的清除能力優于Vc，當Vc、DMY、TBHQ濃度為30～60mg/mL范圍時，DPPH自由基清除率變化不大。

Tab.4DPPH· scavenging activities on Vc,

濃度(mg/mL)DPPH清除率(%)DMYVcTBHQ535.86±0.2aA19.83±0.09B34.81±1.37aA7.551.53±0.14aA29.42±0.14B52.69±0.83aA1061.41±0.04aA38.73±0.17B62.69±0.32aA2091.79±0.14aA76.91±2.82B90.74±0.28aA3094.25±0.15a95.25±0.3a91.76±0.22b4093.43±0.06b97.23±0.14a93.98±0.24b5093.89±0.12b97.3±0.09a91.76±0.29c6093.8±0.07b97.39±0.14a92.13±0.13b

注:同行小寫字母不同表示有顯著差異(P<0.05)，同行大寫字母不同表示有極顯著差異(P< 0.01)， 下同。

圖1　VC、DMY 和TBHQ對 DPPH清除能力

2.2對羥基自由基(·OH)的清除能力

不同DMY、TBHQ和Vc濃度對羥基自由基清除能力的影響，見表5和圖2。

采用Fenton 反應，對DMY清除羥自由基能力進行測定，從圖2可以看出，在試驗濃度范圍內，清除率隨著清除劑含量的增加而逐漸增大，三種清除劑對羥基自由基都表現出一定程度的清除能力，試驗濃度為6 mg/mL時，Vc、TBHQ、DMY的清除能力分別達到617.49 U/mL、513.84% U/mL、495.09 U/mL，DMY組與Vc組有極顯著差異(P< 0.01)，與TBHQ組有顯著差異(P< 0.05)。比較發，相同濃度下對羥基自由基清除能力 Vc > TBHQ > DMY，說明DMY對羥基自由基的清除效果要差一些。

表5DMY、TBHQ和Vc對羥基自由基清除能力

Tab.5　·OH inhibiting activities on Vc,

濃度(mg/mL)清除羥自由基能力(U/mL)DMYVcTBHQ0.01135.19±0.73bB392.79±1.19A152.51±0.68bB0.02252.11±1.00bB438.46±1.32A272.21±1.26bB0.03350.77±1.22bB474.99±1.28A374.52±0.84bB0.04354.42±1.64cB569.99±1.60A449.42±0.39bB0.05469.52±1.22cB571.82±0.63A500.57±0.73bB0.06495.09±2.31bB617.49±0.84A513.84±2.61bB

圖2　DMY、TBHQ和Vc對羥基自由基清除能力

不同DMY、TBHQ濃度對超氧陰離子清除能力的影響，見表6和圖3。

從圖3可以看出，試驗濃度范圍內，DMY、TBHQ對超氧陰離子的清除能力均與其含量呈量效關系，隨著超氧陰離子清除劑含量增加其清除能力逐漸增強。當試驗濃度為0.30 mg/mL 時，DMY、TBHQ的清除能力達到182.61 U/L、186.26 U/L，DMY組與TBHQ相比具有顯著性(P< 0.05)。從總體趨勢來看，二者對超氧陰離子的清除能力相當。

濃度(mg/mL)超氧陰離子自由基(U/L)DMYTBHQ0.05124.81±0.55b128.24±0.86a0.10146.56±0.83A135.88±0.56B0.15157.25±0.94b160.31±0.48a0.20161.83±0.27B171.76±0.29A0.25173.66±0.84b175.95±0.32a0.30186.26±1.08a182.61±1.64b

圖3　DMY、TBHQ對超氧陰離子清除能力

2.4總抗氧化能力的測定

不同DMY、Vc和TBHQ濃度對總抗氧化能力的影響，見表7和圖4。

表7　DMY、Vc和TBHQ總抗氧化能力

從圖4可以看出，在試驗濃度范圍內，DMY、Vc 和TBHQ都表現出一定程度的抗氧化活性，并且呈明顯量效關系，DMY、Vc的總抗氧化效果要好于TBHQ，在濃度為0.30 mg/mL 時，DMY、Vc、TBHQ的總抗氧化能力分別為0.309 U/mL、0.313 U/mL、0.301 U/mL，DMY組較Vc組差異不顯著(P> 0.05)，DMY組較TBHQ組差異顯著(P< 0.05)。

圖4　DMY、Vc和TBHQ總抗氧化能力

3　結　論

[1]王丹丹,王文清,施春陽,熊微,侯小龍,方建國.藤茶中二氫楊梅素含量變異研究進展[J].中藥材,2015(09):1995-1998.

[2]王丹,郁建平,劉灝.藤茶二氫楊梅素抗氧化活性研究[J].山地農業生物學報,2013(03):243-246.

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·研究簡報·

Study on Antioxidant Activity of DihydromyricetininVitro

WANGEn-hua,YANGLi-shou,LUFeng-xiao,QINTian,QINZe-hua,YUJian-ping*

(CollegeofPharmacy,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Dihydromyricetin; Antioxidant activityinvitro; Free radical; Total antioxidant activity

1008-0457(2016)03-0086-05國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.03.017

2016-03-18；修回日期：2016-04-15

貴州省科技廳農業攻關項目“貴州省藤茶資源及深加工研究與應用”([黔科合NY[2011]3094 號)。

郁建平(1956-)，男，博士，主要研究方向：食品化學、天然藥物化學、生化分離工程及農副產品的開發及利用；E-mail: yujp666666@ 163.com。

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