北美海棠組培快繁研究

黃俊軒++劉艷軍++楊靜慧++李建科++李雕

摘 要：為了建立北美海棠組培快繁體系，以北美海棠一年生休眠枝條為外植體，經過體外消毒后，將帶有腋芽的莖段接種到1/2MS培養基上進行無菌苗的培養，然后剪取帶有腋芽的北美海棠無菌苗的莖段接種到含有不同激素濃度的MS培養基上進行再生芽的增殖培養，從中篩選出增殖效果最好的培養基配方組合，之后將再生出的小芽的外植體接種到含有不同激素的伸長生長培養基上進行培養，從中篩選出伸長效果最好的培養基配方，之后待到伸長培養的小苗長到5 cm時，將其從外植體上剪下接種到含有不同生長素的生根培養上進行生根培養，從中篩選出最適的培養基配方。經過不同階段的培養，試驗結果顯示：增殖效果最好的培養基配方為MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1蔗糖；伸長效果最好的培養基為MS+0.5 BA+1.0 IAA+30 g·L-1蔗糖；生根效果最好的為1/2 MS+0. 5 NAA+20 g·L-1蔗糖。本試驗結果將會應用在北美海棠優質苗木的快繁及育種研究中。

關鍵詞：培養基；激素；增殖培養；分化

中圖分類號：S661.4 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.08.006

Abstract： In order to build the rapid propagation system of American Begonia， the annual dormant branches of American Begonia were taking as explants in this test. After disinfection in vitro， stem segment with axillary bud was inoculated onto the 1/2 MS medium for sterile seedling cultivation. Then the bud stem section of American Begonia was inoculated onto the MS medium containing different concentration hormones for bud multiplication culture， and to screen the best medium formula for proliferation. Then the explants with regenerated buds were inoculated onto the MS medium containing different concentration hormones for buds elongation， and to screen the best medium formula for elongation. When the seedlings for elongation were 5 cm long， they were cut off from the explant and inoculated onto the MS medium containing different concentration auxins for rooting culture， and to screen the best medium formula for rooting. Through the cultivation of different stages， the research results showed that the best culture medium formula for proliferation was MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1 sucrose. The best medium for elongation was MS+0.5 BA+1.0 IAA+30 g·L-1 sucrose； for the best medium for rooting was 1/2 MS+0.5 NAA+20 g·L-1sucrose. The test results will be applied in American Begonia fast propagation and breeding study.

Key words： medium； hormone； multiplication culture； differentiation

北美海棠，學名North Americart Begonia，為薔薇科蘋果屬落葉喬木，它是由美國和加拿大的育種者從自然雜交的海棠中選育出來的，已經在北美種植和推廣了幾十年，因此被稱作北美海棠。北美海棠具有很高的觀賞價值，不但其花和果實的色彩豐富，而且許多品種的葉色和枝條亦隨著季節的不同呈現出不同的色彩。另外，北美海棠抗性強，耐寒，耐瘠薄，管理容易，觀賞效果好。北美海棠現已成為北方氣候條件下被廣泛應用的一種重要的園林植物。隨著我國對園林業的大力發展和扶植，市場需要越來越多的優質綠化苗木，北美海棠已經成為優良的綠化資源，并逐漸成為苗木市場的主推品種[1]。在園林綠化中適于列植于道路兩旁，亦可孤植、叢植于草坪上或點綴于巖石旁、湖水邊[2]。

現在園林中應用的主要北美海棠品種有：道格、紅麗、寶石、凱爾斯、粉芽、紅玉、王族、火焰、雪球、鉆石、絢麗、草莓果凍等。其中“凱爾斯”為重瓣花的新品種，“紅玉”海棠為垂枝的品種，“王族”海棠葉色紫紅，是觀花觀葉的優秀品種。這些海棠的花期為4月下旬，花色極為豐富，主要體現在白色、粉色、紫色、紅色等色系中，有不同色深及冷暖色調差異 [3]。

北美海棠作為重要的園林綠化植物新品種，關于它的繁殖方法報道較多。其中多數是關于嫁接與扦插進行繁殖的[4-6]。雖然扦插或嫁接的繁殖方法簡便易行，但受到季節限制及成活率等因素的影響，在生產上很難保證向市場提供充足的北美海棠苗木。另外，采用傳統繁殖方法還會造成繁殖苗木病蟲害的大范圍傳播，不能提供優質的繁殖苗木。隨著現代生物技術的發展，尤其是組織培養技術的廣泛應用，一些綠化用苗木已經開始采用組培繁殖技術進行繁殖，并逐漸取代傳統的嫁接與扦插繁殖方法[7-9]。與后者相比，組培繁殖具有以下優勢：一是繁殖系數高，組培不受季節限制，可以周年生產，同時增殖系數高，繁殖系數相應提高；二是苗木質量優，因為可以通過組培繁殖過程去除母株所帶的病蟲害，得到健壯的繁殖苗木；三是成活率高，節約生產成本。傳統繁殖方法在后期苗木培養過程中經常會由于苗木質量差，管理繁瑣等因素的影響造成成苗率顯著下降的現象，因此，會導致生產成本的增加，尤其是大苗的高死亡率更是嚴重影響了苗木的種植與推廣。而組培苗越到生長后期，生長勢越強，這就保障了苗木的成苗率與成材率。

近年來，關于北美海棠組培快繁的報道越來越多[10-11]，雖然北美海棠的組培研究相對較為簡單，也很容易獲得再生苗，但多數增殖效率并不理想，許多品種還不能做到工廠化生產，因此，本研究主要針對北美海棠組培中這一問題，通過組培中影響其快繁效果的各種因素進行優化試驗，目的就是要建立一套高效的北美海棠組培快繁體系，實現北美海棠試管苗的工廠化生產，為生產上提高充足的組培苗木。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

北美海棠一年生枝條取自天津農學院園林植物教研室實習基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 北美海棠外植體消毒處理 選取生長健壯、無病蟲害的北美海棠一年生枝條，選取時間應在落葉1個月后。在實驗室中用自來水將枝條表面反復沖洗干凈，在超凈工作臺中進行外植體的表面消毒處理。具體操作步驟為：先用70%的酒精將帶有休眠芽的枝條切斷浸泡30 s，然后采用40%的安替福民水溶液進行消毒處理10 min，然后用無菌水進行沖洗3～5次。將洗凈消毒劑的外植體用無菌的濾紙吸干表面水分，然后將其接種到含有10 mg·L-1 GA3的1/2MS培養基上，在溫度為25 ℃，24 h光照下進行休眠芽的萌發培養。

1.2.2 北美海棠的增殖培養 當北美海棠莖段外植體的休眠芽萌發并長到2～3 cm時，將其從外植體上切下，轉移到含有不同生長激素的培養基上進行再生芽的增殖培養。增殖培養采用容積為100 mL的廣口三角瓶，其中加入35 mL的固體培養基。每個處理做8瓶，每瓶接種5個萌發的腋芽。培養條件為25 ℃，24 h光照。經過40 d的培養，統計每種處理腋芽的增殖情況。

1.2.3 北美海棠的伸長培養 當增殖培養的北美海棠芽長到2～3 cm時，在超凈工作臺中將其從芽叢中分離開來，每個單獨的芽分別接種到含有不同激素的MS培養基上，進行再生芽的伸長培養，試驗條件同前。每個處理接種8～10個再生芽，并重復5次，經過30 d的培養，統計每個處理再生芽的伸長情況。

1.2.4 北美海棠的生根培養 當伸長培養的北美海棠苗長到5 cm時，將其轉移到含有不同生長素的培養基上進行再生苗的生根培養。其中每個三角瓶接種5～8個再生苗，并重復5次。培養條件與前面相同。經過30 d后統計北美海棠再生苗的生根情況。

2 結果與分析

2.1 北美海棠的腋芽增殖結果

北美海棠休眠芽在含有GA3的培養基上經過30 d的培養后，腋芽萌發并正常生長。當腋芽長到2～3 cm時將其切下轉接到增殖培養基上進行培養，經過40 d的培養，從腋芽的頂點分生出一定數量的叢生芽，每個處理情況不同，通過對增殖芽數量與生長情況的統計，記錄整理形成表1。

從表1中可以看到，在采用不同分裂素情況下，北美海棠增殖情況明顯不同。從增殖系數來看，采用BA作為分裂素獲得的增殖系數明顯高于KT，且從再生芽生長情況來看，采用BA誘導出的再生芽生長基本健壯，只有BA達到2 mg·L-1時才生長緩慢；相反，采用KT為分裂素，增殖系數明顯低于BA，并且再生芽生長緩慢，且出現玻璃化顯現，說明KT不利于北美海棠的增殖培養。在采用BA為分裂素時，隨著其濃度的增加，增殖系數逐漸增大，但當BA濃度達到2 mg·L-1時，再生芽的生長速度下降，同時增殖系數也降低，說明在適宜的BA作用下北美海棠的增殖效果最好。綜上情況，采用MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1蔗糖的培養基最適于北美海棠增殖培養。

2.2 北美海棠的伸長培養結果

將增殖培養中長出的再生芽剪下，接種到含有不同激素的培養基上進行伸長培養，經過大約30 d的培養，再生芽開始伸長，試驗結果見表2。

從表2中可以看到，不同激素組合對北美海棠分化的影響不同。其影響變化主要決定于分裂素與生長素的比例，當分裂素/生長素的比值較高時，再生芽仍然保持分化狀態，并有新的再生苗長出，而原來的再生芽也不再伸長。如果繼續延長培養時間則會造成再生芽玻璃化并褐變死亡，不能得到生長健壯的再生苗。相反，當其比例降低時，即采用較高的生長素時，分化現象受到抑制，而出現再生苗迅速伸長生長現象。從表2可以看到，適宜的分裂素/生長素的比值可以獲得較好的再生苗伸長效果，結合再生苗的生長于伸長情況，在MS+0.5 BA+1.0 IAA的培養基上獲得的北美海棠伸長效果最好。

2.3 北美海棠的生根試驗結果

待伸長培養的北美海棠苗長到5 cm左右時，在超凈臺中將其剪下，接種到含有生根培養基的三角瓶中。經過大約一周的時間，在組培苗的基部就有根出現，經過30 d的培養，在每種培養基的瓶中，生根情況出現明顯的不同，具體情況見表3。

北美海棠屬于木本植物，組培生根較困難，因此，筆者采用較低滲透壓的1/2 MS作為基本培養基，同時附加20 g·L-1的蔗糖。從表3中的數據可以看出：

首先，不同生長素對北美海棠的生根影響不同，IAA雖然能夠使得組培苗生根，但從數量與根長來看多表現為較低的數值，而且從生根的質量上看，在IAA培養基上誘導出的根都是短粗的肉質根。這種根基本不具備根的基本功能，除了具有被動的吸收之外，不具有真正根的任何生理機能，因此，即使進行帶根移栽，這樣的組培苗一般都不能成活。因此，這類生根沒有實際意義。這一現象說明，北美海棠組培苗對IAA表現不好，相反，采用NAA則可以獲得生長正常、健壯的根，而且數量和根長都十分理想，因此，NAA適宜作為誘導北美海棠組培苗生根的激素。

其次，在采用NAA進行誘導生根時可以見到，隨著NAA使用濃度的增加，可以誘導出數量較多的再生根，但當NAA的濃度達到1.0 mg·L-1時，生根質量出現明顯變化，根的長度減小，并且粗度變細，呈現出簇生狀態。這種根也與IAA誘導出的肉質根相似，移栽時容易造成組培苗根的傷害，從而造成微生物感染，導致移栽成活率下降，因此，在生產上不采用這類生根苗進行移栽。

綜上情況，在北美海棠生根試驗中，采用1/2 MS+0. 5 NAA+20 g·L-1蔗糖的培養基可以獲得理想的生根苗。

3 討 論

3.1 不同分裂素對北美海棠增殖的影響

在本試驗中，筆者采用了2種分裂素，即BA與KT。從試驗結果可以看出，BA明顯優于KT，這說明北美海棠的增殖更適于BA。一般在誘導增殖的組培研究中，分裂素是必需的，因為組織的分化與生長是一定的分裂素與生長素共同作用的結果，當分裂素較高時，更利于組織分化，如增殖生長。相反，如果生長素較高則利于組織的增大生長，表現出組培材料生長速度加快。雖然如此，但每種植物對分裂素的選擇是不同的。當采用某一分裂素進行誘導增殖培養時，如果通過改變其濃度不能收到理想的結果時，一般要考慮更換新的分裂素。因為植物對分裂素的種類是有所選擇的，所以在木本植物進行增殖培養時，一般采用KT，而草本植物多采用BA。在本試驗中結果正好相反，因此，這一規律也并不適于所有物種。因此，在進行植物增殖培養研究中，具體采用哪種分裂素還是以試驗結果為準。

3.2 組培快繁中增殖率對繁殖效率的影響

在進行組培快繁研究中，影響繁殖系數的主要指標就是增殖率，即增殖系數。一般認為增殖率越高，繁殖效率也就相應增高，但在實際生產中這一原則也是不準確的。具體原因主要有以下幾方面。第一，過高的增殖率會影響增殖芽的質量。由于增殖系數過高，再生芽的數量太大，勢必造成其生長緩慢，且由于營養競爭，實際上許多再生芽在生長過程中會被淘汰，只有少量存活下來，反而降低了增殖率。同時生長過慢，也最終影響繁殖效率；第二，如果只求較高的增殖率，也會需要高濃度的分裂素，如果分裂素過高，就會造成其對植物的毒害作用，比較明顯的現象就是會造成組培苗產生玻璃化，因此，即使增殖系數再高，但再生芽的質量很差，一樣會導致實際的繁殖效果降低。因此，要在不造成再生芽傷害的前提下，適當增加分裂素的用量，以此增加其增殖率，才能收到理想的快繁效果；第三，過高的增殖系數會導致再生芽個體較小，在進行切分操作中會對再生芽造成較大的傷害，導致再生苗在轉移過程中影響其以后的生長速度，甚至造成死亡，因此，在實際生產中也不會使得快繁效率增加。綜上幾個原因，在進行植物組培快繁研究中，在追求增殖率的同時也要考慮再生芽的質量，適宜的增殖系數是實現組培快繁效率的關鍵。

3.3 滲透壓對生根的影響

滲透壓對于組培苗生根很重要，因為植物生根需要較低的滲透壓，低滲透壓利于根原基的形成及根的快速伸長。在本試驗中，采用1/2 MS，降低培養基中離子強度，從而使得培養基的滲透壓降低，同時又采用了20 g·L-1的蔗糖，這也是降低滲透壓的一種做法。雖然降低滲透壓利于生根培養，但也應考慮組培苗的實際情況。首先，過低的滲透壓是犧牲培養基中的營養成分（如無機鹽或糖）換來的，因此，勢必造成組培苗從培養基中獲取營養的水平下降，一旦營養不足就會導致生根的效率下降，造成生根數量和生長速度的下降，不但不能增加生根率，相反還影響了生根的效果。其次，要根據組培苗的實際生長情況決定是否采用低滲透壓。在本試驗中，北美海棠組培苗在進行生根時生長的十分健壯，即使培養基營養缺乏，其也可以借助自身的營養積累實現生根。相反，如果組培苗生長較弱，應盡量避免采用低營養的培養基。因此，在實際生產中一定要根據具體情況適當降低滲透壓來提高組培苗的生根效率。

4 結 論

北美海棠是一種重要的園林植物品種，因此，組培快繁對于其應用與推廣具有十分重要的意義。本試驗對其快繁中的主要技術指標進行了研究，具體操作規程總結歸納如下。（1）外植體獲取。取休眠枝條，采用40%的安替福民水溶液進行消毒處理10 min，無菌水沖洗后，接種到含有10 mg·L-1 GA3的1/2 MS培養基上誘導腋芽的萌發；（2）增殖培養。將無菌芽接種到MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1蔗糖的培養基進行增殖培養，經過40 d的培養獲得再生芽；（3）伸長培養。將增殖培養長的再生芽剪下，接種到MS+0.5 BA+1.0 IAA+30 g·L-1蔗糖的培養基上，30 d后獲得伸長的組培苗。（4）生根培養。將長到5 cm的組培苗接種到1/2 MS+0. 5 NAA+20 g·L-1蔗糖的培養基上，經過30 d的培養可以獲得理想的生根苗。本試驗結果對于北美海棠組培快繁意義重大，可以直接應用于北美海棠的工廠化育苗的生產。

參考文獻：

[1]劉朝華，儲博彥.北美海棠優良品種簡介及栽培技術[J].河北林業科技，2014 （1）：102-103.

[2]姜永峰，唐世勇，邢英麗，等.北美海棠品種及在北方園林景觀中的應用[J].農業科技通訊，2014 （10）：277-278.

[3]史立華.北美海棠產業化栽培技術[J].現代農業科技， 2014 （21）：158-159.

[4]陳鵬.北美海棠的繁殖與栽培[J]. 花木盆景（花卉園藝）， 2013（10）：16-17.

[5]趙志新.北美海棠微扦插繁殖試驗[J].天津農業科學， 2012，18（1）：123-125.

[6]李進章.北美海棠嫁接繁殖方法研究[J].中國園藝文摘，2012 （8）：119-120.

[7]王清連.植物組織培養[M].北京：中國農業出版社， 1998：186-199.

[8]曹孜義，劉國民.實用植物組織培養技術教程[M].蘭州：甘肅科學技術出版社，2002：89-102.

[9]郭偉珍，林艷，徐立軍，等.美洲南蛇藤的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學通訊，2008，44（2）：295.

[10]瞿珍，常黎明.西寧地區北美海棠初代組織培養技術研究[J].黑龍江農業科學，2011 （9）：11-12， 29.

[11]趙志新.北美海棠組培快繁技術[J].農業科技通訊，2011 （12）：186-187.