實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法比較豬瘟疫苗病毒含量

章秋月　馬華魁　鄭新平　陳鵬強(qiáng)　陳秋勇　胡崇偉　修金生　吳波平（.南平市星星畜牧有限公司　福建南平　353000；.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院　福州　35000；3.福建省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心　福州　350003）

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法比較豬瘟疫苗病毒含量

章秋月1馬華魁1鄭新平1陳鵬強(qiáng)2陳秋勇2胡崇偉2修金生2吳波平3*
（1.南平市星星畜牧有限公司福建南平353000；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院福州350002；3.福建省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心福州350003）

為有效檢測(cè)福建省使用豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量，給養(yǎng)殖戶(hù)選擇高效疫苗提供科學(xué)指導(dǎo)。本研究收集福建省內(nèi)使用的10個(gè)不同廠家生產(chǎn)的23個(gè)批次豬瘟疫苗，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)疫苗中病毒核酸的含量，以其中的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，比較相應(yīng)的兔體反應(yīng)量。結(jié)果表明：抽檢23個(gè)豬瘟疫苗樣品合格率僅為69.56%，傳代細(xì)胞苗的病毒含量相對(duì)較高，脾淋苗病毒含量?jī)?yōu)于細(xì)胞苗；不同廠家生產(chǎn)的同類(lèi)型疫苗病毒含量差異大，同一廠家生產(chǎn)的同類(lèi)疫苗存在批間差異。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬瘟疫苗病毒含量是一種便捷、高效的方法，為今后臨床豬瘟疫苗的使用提供有效指導(dǎo)依據(jù)。

豬瘟疫苗熒光定量RT-PCRTaqMan探針病毒含量

豬瘟（Classical swine fever，CSFV）是一種高度接觸性傳染病，遍布于全世界，OIE將其列為A類(lèi)傳染病，是目前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)殺手，嚴(yán)重阻礙我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展［1］。豬瘟兔化弱毒疫苗，簡(jiǎn)稱(chēng)“C”株（Chinese strain），是目前世界公認(rèn)的最好的豬瘟疫苗，在中國(guó)豬瘟防控中起著重要的作用［2-3］。但近年來(lái)，我國(guó)豬瘟疫苗免疫失敗的病例逐漸增多，疫苗質(zhì)量達(dá)不到要求是其中一個(gè)重要原因。我國(guó)對(duì)于豬瘟的防控主要以豬瘟兔化弱毒疫苗的大規(guī)模免疫為主，長(zhǎng)期的臨床使用和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)都表明，豬瘟兔化弱毒疫苗能夠?yàn)楸幻庖邉?dòng)物長(zhǎng)時(shí)間提供廣譜、持久、堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)力，表現(xiàn)出極高的穩(wěn)定性，理論上具有極佳的效力。但是為了能夠在臨床使用時(shí)發(fā)揮疫苗的最大作用，就必須實(shí)現(xiàn)對(duì)商品化疫苗質(zhì)量的有效控制。疫苗質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)就是要保證所生產(chǎn)疫苗具有符合標(biāo)準(zhǔn)的效價(jià)，能夠確實(shí)激活被免疫動(dòng)物的免疫系統(tǒng)［4-7］。

由于豬瘟病毒不能產(chǎn)生細(xì)胞病變，國(guó)標(biāo)中對(duì)病毒含量或疫苗效力檢驗(yàn)主要依靠兔體定型熱反應(yīng)方法，該方法試驗(yàn)成本較高、操作繁瑣、試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，且受試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異、環(huán)境因素等多方面原因影響，檢測(cè)結(jié)果不是十分準(zhǔn)確［8-9］。因此，建立新型實(shí)用、標(biāo)準(zhǔn)化疫苗效力檢驗(yàn)替代方法勢(shì)在必行。熒光定量RT-PCR方法可以對(duì)病毒含量實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有特異、敏感、快速、高通量和實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，為豬瘟病毒含量測(cè)定及豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)提供了新的技術(shù)支持［10］。本研究采用RT-PCR方法結(jié)合熒光探針的擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)熒光信號(hào)的變化檢測(cè)豬瘟病毒RNA，相對(duì)定量對(duì)比各批次間豬瘟疫苗的抗原含量。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料Hight Pure Viral RNA Kit購(gòu)自Roche；PRRSV熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京生科尚儀；常規(guī)化學(xué)試劑、耗材和藥品均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2待檢疫苗收集省內(nèi)使用的由10個(gè)廠家生產(chǎn)（A～J）的23種不同類(lèi)型、不同批次疫苗，包括傳代細(xì)胞苗、細(xì)胞苗、脾淋苗。

1.3病毒核酸提取將待檢疫苗用滅菌生理鹽水配制成20頭份/mL原液，反復(fù)凍融3次后，3 000 r/ min離心2 min，取上清。按照動(dòng)物組織基因組RNA提取試劑盒（Hight Pure Viral RNA Kit）操作方法提取疫苗RNA，洗脫核酸，后置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法豬瘟疫苗病毒含量檢測(cè)按照北京生科尚儀的方法進(jìn)行：反應(yīng)體系25 μL，其中 RT-PCR反應(yīng)液 15 μL、Taq酶0.25 μL、模板 RNA 10 μL。反應(yīng)條件為42℃、30 min，92℃、3 min后進(jìn)入第一個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為92℃、10 s，45℃、30 s，72℃、60 s；5個(gè)循環(huán)后進(jìn)入第二個(gè)循環(huán)，參數(shù)為92℃、10 s，60℃、30 s，40個(gè)循環(huán)；60℃時(shí)收集熒光。

2　結(jié)果與分析

2.1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)1-23#豬瘟疫苗樣品，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2疫苗抗原含量檢測(cè)結(jié)果分析通過(guò)熒光定量RT-PCR對(duì)疫苗的抗原含量進(jìn)行檢測(cè)，以9號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品為參照校準(zhǔn)相應(yīng)的RID值。結(jié)果表明：17-23#豬瘟活疫苗抗原量不合格，抽檢樣品合格率僅為69.56%；傳代細(xì)胞苗的抗原量明顯優(yōu)于細(xì)胞苗和脾淋苗，檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)脾淋苗的抗原量?jī)?yōu)于細(xì)胞苗；不同廠家生產(chǎn)的同一類(lèi)型疫苗，疫苗抗原量差異大，同一廠家生產(chǎn)的同種疫苗批間差異較大；以9號(hào)樣品為參照標(biāo)準(zhǔn)，換算出各批次的大致兔體反應(yīng)量，檢測(cè)仍發(fā)現(xiàn)有部分廠家生產(chǎn)的豬瘟活疫苗抗原量為0以及不符合國(guó)標(biāo)的疫苗（見(jiàn)表1）。

3　討　論

1）目前，我國(guó)豬群流行的CSFV基因型仍以2.1亞型為主，2.1b類(lèi)毒株為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)流行毒株。根據(jù)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所王琴等［11-15］證實(shí)，豬瘟“C株”兔化弱毒疫苗對(duì)不同基因型CSFV毒株仍能提供有效保護(hù)，產(chǎn)生良好的體液和細(xì)胞免疫。李安等［12］建立基于SYBR Green iv實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬瘟疫苗病毒含量，進(jìn)一步說(shuō)明熒光定量RT-PCR代替兔體定型熱反應(yīng)的可行性。盡管客觀上講，熒光定量RT-PCR方法只能對(duì)CSFV疫苗中的核酸進(jìn)行定量，但當(dāng)選擇恰當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品并在同一反應(yīng)體系的前提下，核酸含量的多少還是能在較大程度上反映出病毒含量的高低。

2）當(dāng)前養(yǎng)殖場(chǎng)的豬瘟免疫意識(shí)和生豬的豬瘟免疫密度都較高，80%以上豬群均注射過(guò)兔化弱毒疫苗，種豬場(chǎng)幾乎是100%免疫。但臨床走訪和檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，豬瘟免疫合格的養(yǎng)殖場(chǎng)比例并不高，僅在70%左右。豬瘟免疫失敗的原因，一方面與臨床使用的部分廠家豬瘟疫苗質(zhì)量有關(guān)，另一方面與豬體的健康程度、免疫程序、母源抗體的影響及市場(chǎng)化疫苗的冷鏈系統(tǒng)等方面的問(wèn)題有關(guān)。我國(guó)有優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)種毒，但因諸如細(xì)胞源疫苗、組織苗和傳代細(xì)胞苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不同，生產(chǎn)工藝的多樣化及不良市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)等，豬瘟疫苗的嚴(yán)格統(tǒng)一管理和質(zhì)量控制存在一定困難，導(dǎo)致臨床上豬瘟免疫效果不理想。

3）豬瘟病毒基因組穩(wěn)定，變異頻率低，只有一個(gè)血清型，且豬瘟疫苗依然是最優(yōu)秀的疫苗［15-17］，這些都為豬瘟的控制提供了技術(shù)保障。規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)只要做好生物安全措施，堅(jiān)決淘汰病原陽(yáng)性豬，隔離圈建設(shè)與全面定期消毒，加大后備豬篩選和監(jiān)測(cè)力度，嚴(yán)格人員出入，使用合格抗原量高的豬瘟疫苗，豬瘟是完全能夠控制的。

表1　豬瘟疫苗抗原含量檢測(cè)結(jié)果匯總表

［1］王海光.豬瘟兔化弱毒ST傳代細(xì)胞源疫苗效檢替代方法和豬瘟病毒鑒別檢測(cè)方法的建立［D］.北京：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，2013.

［2］唐紅慧.豬瘟兔化弱毒苗抗原量測(cè)定方法的探索及不同免疫程序的差異性比較研究［D］.揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2010.

［3］姚華偉.豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法及疫苗中牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)方法的研究［D］.重慶：西南大學(xué)，2011.

［4］李晶.豬瘟兔化弱毒疫苗國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的初步研究與建立［D］.重慶：西南大學(xué)，2009.

［5］鄧力.豬瘟兔化弱毒一步法熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

［6］薛孝倫.豬瘟兔化弱毒乳兔組織濕苗含毒量測(cè)定［J］.四川農(nóng)業(yè)科技，1981（1）：19-20.

［7］李春紅，唐滿(mǎn)華，陳瑞愛(ài).豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法研究進(jìn)展［J］.當(dāng)代畜牧，2014（12）：34-39.

［8］祖立闖，謝金文，沈志強(qiáng)，等.豬瘟疫苗質(zhì)量的替代檢驗(yàn)方法研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015（2）：76-79.

［9］陳鍇，姚華偉，王長(zhǎng)江，等.熒光定量PCR作為豬瘟兔化弱毒疫苗效價(jià)檢驗(yàn)替代方法的研究與應(yīng)用 ［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（1）：162-169.

［10］范學(xué)政，寧宜寶，王琴，等.用RT-PCR方法檢測(cè)豬瘟細(xì)胞苗中污染牛病毒性腹瀉病毒 ［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010 （1）：8-10.

［11］王琴.我國(guó)豬瘟的分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及防控［J］.豬業(yè)科學(xué)，2010（1）：82-84.

［12］李安，崔言順，沈志強(qiáng)，等.SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬瘟疫苗病毒含量 ［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010（8）：1018-1022.

［13］李麗，陳弟詩(shī)，張毅，等.豬瘟病毒及豬瘟疫苗的研究進(jìn)展［J］.當(dāng)代畜牧，2014（8）：48-49.

［14］王琴，趙耘，范學(xué)政，等.國(guó)內(nèi)部分豬瘟病毒流行株抗原性分析［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012（6）：436-439.

［15］王琴.豬瘟流行現(xiàn)狀及中國(guó)豬瘟凈化策略［J］.中國(guó)豬業(yè)，2012（10）：45-47.

［16］劉俊，王琴，范學(xué)政，等.豬瘟病毒野毒株TaqMan-MGB熒光定量PCR鑒別方法的建立與應(yīng)用［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（12）：4366-4371.

［17］王毅，王琴，魯小璐，等.豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）減毒的分子機(jī)制研究［C］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)生物制品學(xué)分會(huì)，中國(guó)微生物學(xué)會(huì)獸醫(yī)微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì).首屆中國(guó)獸藥大會(huì)--獸醫(yī)生物制品學(xué)、獸醫(yī)微生物學(xué)學(xué)術(shù)論壇論文集，2008.

Comparison of virus content in swine fever vaccine by fluorogenetic quantitative RT-PCR

Zhang Qiuyue1Ma Huakui1Zheng Xinping1Chen Pengqiang2Chen Qiuyong2Hu Chongwei2Xiu Jinsheng2Wu Boping3*
（1.Nanping Xingxing Animal Husbandry Co.，Ltd.，Nanping，F(xiàn)ujian 353000；2.College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002；3.Animal Disease Prevention and Control Center of Fujian Province，F(xiàn)uzhou 350003）

To effectively detect the quantity of the viral in swine vaccine in Fujian province，select high effective vaccine for the farms，23 batches vaccine from 10 different companies collected and used real-time PCR to detect the quantity of the viral.Using standard substance as control，we compared the corresponding RID.The result showed that the percent of pass in 23 batches vaccine is only 69.5%.The quantity of viral in passaged cell vaccine is relative high and the quantity of the viral in spleen vaccine is better than others.There is a big differences between different companies and between different batches in one company.Real-time PCR is an convenient and effective method to detect the quantity of the viral in swine vaccine and can provide useful guideline for selecting vaccine.

Swine vaccine qRT-PCR TaqMan Viral load

A

1003-4331（2016）04-0003-03

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（2014-01）、福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013J05042）資助。

章秋月（1988-），女，碩士生。
*

吳波平（1980-），男，獸醫(yī)師，從事動(dòng)物疫病流行病學(xué)調(diào)查。E-mail：boping_wu@163.com。