實時熒光定量RT-PCR法比較豬瘟疫苗病毒含量

章秋月　馬華魁　鄭新平　陳鵬強　陳秋勇　胡崇偉　修金生　吳波平（.南平市星星畜牧有限公司　福建南平　353000；.福建農林大學動物科學學院　福州　35000；3.福建省動物疫病預防控制中心　福州　350003）

實時熒光定量RT-PCR法比較豬瘟疫苗病毒含量

章秋月1馬華魁1鄭新平1陳鵬強2陳秋勇2胡崇偉2修金生2吳波平3*
（1.南平市星星畜牧有限公司福建南平353000；2.福建農林大學動物科學學院福州350002；3.福建省動物疫病預防控制中心福州350003）

為有效檢測福建省使用豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量，給養殖戶選擇高效疫苗提供科學指導。本研究收集福建省內使用的10個不同廠家生產的23個批次豬瘟疫苗，應用實時熒光定量RT-PCR方法檢測疫苗中病毒核酸的含量，以其中的標準品對照，比較相應的兔體反應量。結果表明：抽檢23個豬瘟疫苗樣品合格率僅為69.56%，傳代細胞苗的病毒含量相對較高，脾淋苗病毒含量優于細胞苗；不同廠家生產的同類型疫苗病毒含量差異大，同一廠家生產的同類疫苗存在批間差異。實時熒光定量RT-PCR檢測豬瘟疫苗病毒含量是一種便捷、高效的方法，為今后臨床豬瘟疫苗的使用提供有效指導依據。

豬瘟疫苗熒光定量RT-PCRTaqMan探針病毒含量

豬瘟（Classical swine fever，CSFV）是一種高度接觸性傳染病，遍布于全世界，OIE將其列為A類傳染病，是目前危害我國養豬業的頭號殺手，嚴重阻礙我國養豬業的健康發展［1］。豬瘟兔化弱毒疫苗，簡稱“C”株（Chinese strain），是目前世界公認的最好的豬瘟疫苗，在中國豬瘟防控中起著重要的作用［2-3］。但近年來，我國豬瘟疫苗免疫失敗的病例逐漸增多，疫苗質量達不到要求是其中一個重要原因。我國對于豬瘟的防控主要以豬瘟兔化弱毒疫苗的大規模免疫為主，長期的臨床使用和實驗室檢測都表明，豬瘟兔化弱毒疫苗能夠為被免疫動物長時間提供廣譜、持久、堅強的保護力，表現出極高的穩定性，理論上具有極佳的效力。但是為了能夠在臨床使用時發揮疫苗的最大作用，就必須實現對商品化疫苗質量的有效控制。疫苗質量控制的重要環節就是要保證所生產疫苗具有符合標準的效價，能夠確實激活被免疫動物的免疫系統［4-7］。

由于豬瘟病毒不能產生細胞病變，國標中對病毒含量或疫苗效力檢驗主要依靠兔體定型熱反應方法，該方法試驗成本較高、操作繁瑣、試驗周期較長，且受試驗動物個體差異、環境因素等多方面原因影響，檢測結果不是十分準確［8-9］。因此，建立新型實用、標準化疫苗效力檢驗替代方法勢在必行。熒光定量RT-PCR方法可以對病毒含量實時監測，具有特異、敏感、快速、高通量和實時等優點，為豬瘟病毒含量測定及豬瘟疫苗效力檢驗提供了新的技術支持［10］。本研究采用RT-PCR方法結合熒光探針的擴增檢測技術，通過熒光信號的變化檢測豬瘟病毒RNA，相對定量對比各批次間豬瘟疫苗的抗原含量。

1　材料與方法

1.1試驗材料Hight Pure Viral RNA Kit購自Roche；PRRSV熒光RT-PCR檢測試劑盒購自北京生科尚儀；常規化學試劑、耗材和藥品均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2待檢疫苗收集省內使用的由10個廠家生產（A～J）的23種不同類型、不同批次疫苗，包括傳代細胞苗、細胞苗、脾淋苗。

1.3病毒核酸提取將待檢疫苗用滅菌生理鹽水配制成20頭份/mL原液，反復凍融3次后，3 000 r/ min離心2 min，取上清。按照動物組織基因組RNA提取試劑盒（Hight Pure Viral RNA Kit）操作方法提取疫苗RNA，洗脫核酸，后置于-20℃備用。

1.4實時熒光RT-PCR檢測方法豬瘟疫苗病毒含量檢測按照北京生科尚儀的方法進行：反應體系25 μL，其中 RT-PCR反應液 15 μL、Taq酶0.25 μL、模板 RNA 10 μL。反應條件為42℃、30 min，92℃、3 min后進入第一個循環，循環參數為92℃、10 s，45℃、30 s，72℃、60 s；5個循環后進入第二個循環，參數為92℃、10 s，60℃、30 s，40個循環；60℃時收集熒光。

2　結果與分析

2.1實時熒光定量RT-PCR檢測結果檢測1-23#豬瘟疫苗樣品，結果見圖1。

2.2疫苗抗原含量檢測結果分析通過熒光定量RT-PCR對疫苗的抗原含量進行檢測，以9號標準品為參照校準相應的RID值。結果表明：17-23#豬瘟活疫苗抗原量不合格，抽檢樣品合格率僅為69.56%；傳代細胞苗的抗原量明顯優于細胞苗和脾淋苗，檢測還發現脾淋苗的抗原量優于細胞苗；不同廠家生產的同一類型疫苗，疫苗抗原量差異大，同一廠家生產的同種疫苗批間差異較大；以9號樣品為參照標準，換算出各批次的大致兔體反應量，檢測仍發現有部分廠家生產的豬瘟活疫苗抗原量為0以及不符合國標的疫苗（見表1）。

3　討　論

1）目前，我國豬群流行的CSFV基因型仍以2.1亞型為主，2.1b類毒株為絕對優勢流行毒株。根據中國獸醫藥品監察所王琴等［11-15］證實，豬瘟“C株”兔化弱毒疫苗對不同基因型CSFV毒株仍能提供有效保護，產生良好的體液和細胞免疫。李安等［12］建立基于SYBR Green iv實時熒光定量RT-PCR檢測豬瘟疫苗病毒含量，進一步說明熒光定量RT-PCR代替兔體定型熱反應的可行性。盡管客觀上講，熒光定量RT-PCR方法只能對CSFV疫苗中的核酸進行定量，但當選擇恰當的標準品并在同一反應體系的前提下，核酸含量的多少還是能在較大程度上反映出病毒含量的高低。

2）當前養殖場的豬瘟免疫意識和生豬的豬瘟免疫密度都較高，80%以上豬群均注射過兔化弱毒疫苗，種豬場幾乎是100%免疫。但臨床走訪和檢測發現，豬瘟免疫合格的養殖場比例并不高，僅在70%左右。豬瘟免疫失敗的原因，一方面與臨床使用的部分廠家豬瘟疫苗質量有關，另一方面與豬體的健康程度、免疫程序、母源抗體的影響及市場化疫苗的冷鏈系統等方面的問題有關。我國有優質的基礎種毒，但因諸如細胞源疫苗、組織苗和傳代細胞苗質量標準不同，生產工藝的多樣化及不良市場競爭等，豬瘟疫苗的嚴格統一管理和質量控制存在一定困難，導致臨床上豬瘟免疫效果不理想。

3）豬瘟病毒基因組穩定，變異頻率低，只有一個血清型，且豬瘟疫苗依然是最優秀的疫苗［15-17］，這些都為豬瘟的控制提供了技術保障。規模化養殖場只要做好生物安全措施，堅決淘汰病原陽性豬，隔離圈建設與全面定期消毒，加大后備豬篩選和監測力度，嚴格人員出入，使用合格抗原量高的豬瘟疫苗，豬瘟是完全能夠控制的。

表1　豬瘟疫苗抗原含量檢測結果匯總表

［1］王海光.豬瘟兔化弱毒ST傳代細胞源疫苗效檢替代方法和豬瘟病毒鑒別檢測方法的建立［D］.北京：中國獸醫藥品監察所，2013.

［2］唐紅慧.豬瘟兔化弱毒苗抗原量測定方法的探索及不同免疫程序的差異性比較研究［D］.揚州：揚州大學，2010.

［3］姚華偉.豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法及疫苗中牛病毒性腹瀉病毒檢測方法的研究［D］.重慶：西南大學，2011.

［4］李晶.豬瘟兔化弱毒疫苗國家標準品的初步研究與建立［D］.重慶：西南大學，2009.

［5］鄧力.豬瘟兔化弱毒一步法熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用［D］.楊凌：西北農林科技大學，2010.

［6］薛孝倫.豬瘟兔化弱毒乳兔組織濕苗含毒量測定［J］.四川農業科技，1981（1）：19-20.

［7］李春紅，唐滿華，陳瑞愛.豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法研究進展［J］.當代畜牧，2014（12）：34-39.

［8］祖立闖，謝金文，沈志強，等.豬瘟疫苗質量的替代檢驗方法研究進展［J］.動物醫學進展，2015（2）：76-79.

［9］陳鍇，姚華偉，王長江，等.熒光定量PCR作為豬瘟兔化弱毒疫苗效價檢驗替代方法的研究與應用 ［J］.中國農業科學，2013（1）：162-169.

［10］范學政，寧宜寶，王琴，等.用RT-PCR方法檢測豬瘟細胞苗中污染牛病毒性腹瀉病毒 ［J］.中國獸醫雜志，2010 （1）：8-10.

［11］王琴.我國豬瘟的分子流行病學監測及防控［J］.豬業科學，2010（1）：82-84.

［12］李安，崔言順，沈志強，等.SYBRGreenⅠ實時熒光定量RT-PCR檢測豬瘟疫苗病毒含量 ［J］.中國獸醫學報，2010（8）：1018-1022.

［13］李麗，陳弟詩，張毅，等.豬瘟病毒及豬瘟疫苗的研究進展［J］.當代畜牧，2014（8）：48-49.

［14］王琴，趙耘，范學政，等.國內部分豬瘟病毒流行株抗原性分析［J］.中國預防獸醫學報，2012（6）：436-439.

［15］王琴.豬瘟流行現狀及中國豬瘟凈化策略［J］.中國豬業，2012（10）：45-47.

［16］劉俊，王琴，范學政，等.豬瘟病毒野毒株TaqMan-MGB熒光定量PCR鑒別方法的建立與應用［J］.中國農業科學，2009（12）：4366-4371.

［17］王毅，王琴，魯小璐，等.豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）減毒的分子機制研究［C］.中國畜牧獸醫學會生物制品學分會，中國微生物學會獸醫微生物學專業委員會.首屆中國獸藥大會--獸醫生物制品學、獸醫微生物學學術論壇論文集，2008.

Comparison of virus content in swine fever vaccine by fluorogenetic quantitative RT-PCR

Zhang Qiuyue1Ma Huakui1Zheng Xinping1Chen Pengqiang2Chen Qiuyong2Hu Chongwei2Xiu Jinsheng2Wu Boping3*
（1.Nanping Xingxing Animal Husbandry Co.，Ltd.，Nanping，Fujian 353000；2.College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002；3.Animal Disease Prevention and Control Center of Fujian Province，Fuzhou 350003）

To effectively detect the quantity of the viral in swine vaccine in Fujian province，select high effective vaccine for the farms，23 batches vaccine from 10 different companies collected and used real-time PCR to detect the quantity of the viral.Using standard substance as control，we compared the corresponding RID.The result showed that the percent of pass in 23 batches vaccine is only 69.5%.The quantity of viral in passaged cell vaccine is relative high and the quantity of the viral in spleen vaccine is better than others.There is a big differences between different companies and between different batches in one company.Real-time PCR is an convenient and effective method to detect the quantity of the viral in swine vaccine and can provide useful guideline for selecting vaccine.

Swine vaccine qRT-PCR TaqMan Viral load

A

1003-4331（2016）04-0003-03

福建省農業科學技術項目（2014-01）、福建省自然科學基金項目（2013J05042）資助。

章秋月（1988-），女，碩士生。
*

吳波平（1980-），男，獸醫師，從事動物疫病流行病學調查。E-mail：boping_wu@163.com。