不同禽流感病毒含量的新-流二聯滅活疫苗免疫SPF雞后抗體水平的監測

江興華　趙華娥　林曉榮　包松英　崔龍萍　王全溪

（1.福州大北農生物技術有限公司　福州　350014；2.福建農林大學動物科學學院　福州　350002）

不同禽流感病毒含量的新-流二聯滅活疫苗免疫SPF雞后抗體水平的監測

江興華1趙華娥1林曉榮1包松英1崔龍萍1王全溪2*

（1.福州大北農生物技術有限公司福州350014；2.福建農林大學動物科學學院福州350002）

將未濃縮的新城疫抗原分別與未濃縮的、濃縮3倍、濃縮6倍的禽流感抗原混合，并制備成三組雞新城疫、禽流感（H9N2 HP株）二聯滅活疫苗（簡稱新-流二聯滅活疫苗），分別免疫21日齡SPF雞，每羽0.3 mL，同時設置未免疫的空白對照組，免疫組與對照組均在免疫前及免疫后7、14、21、28、35 d進行采血，檢測新城疫和禽流感抗體。結果發現，各免疫組在免后不同日齡的新城疫抗體基本一致，禽流感病毒抗原濃縮倍數越高（即禽流感病毒含量越高）的新-流二聯滅活疫苗，免后14、21 d的抗體也越高；從免后21 d開始，各免疫組的禽流感抗體水平差異逐漸減小，免疫后禽流感抗體水平的高低可以反映該疫苗的免疫效果。試驗結果表明，該疫苗可以通過濃縮提高抗原病毒含量的方法來提高免后早期抗體水平，取得良好的早期免疫效果。

新城疫禽流感不同病毒含量二聯滅活疫苗SPF雞抗體水平監測

雞新城疫是由新城疫病毒引起的一種烈性病毒性傳染病，禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一種禽的急性、接觸性、烈性傳染病［1］，兩種疫病均是影響養禽業發展的主要疾病。在我國，低致病性禽流感以H9N2亞型為主型，流行范圍廣，占禽流感陽性雞群總數的93.6%［2］；H9N2亞型禽流感傳播能力強，感染發病率高，可造成雞群產蛋下降及嚴重影響肉雞生長速度，與其他病原共同感染導致高死亡率，給養禽業帶來巨大的經濟損失［3-5］。疫苗免疫是防止新城疫、禽流感暴發和造成巨大損失的主動措施、關鍵環節和最后防線［6］。因此，研制安全有效的疫苗，對雞群進行免疫接種，使雞群產生免疫力，以保護雞群免受新城疫、禽流感的侵害是我國畜牧業發展的迫切需要，是防控新城疫、禽流感的當務之急［7］。目前市場上的新-流疫苗質量不一、免疫效果差別較大。眾所周知，影響疫苗免疫效果的因素很多，抗原病毒含量的高低是其中一項重要影響因素。本研究通過濃縮的方法制備不同流感病毒含量組別的雞新城疫、禽流感（H9N2 HP株）二聯滅活疫苗，監測不同組別疫苗免后的抗體水平，觀察二聯滅活疫苗的使用效果，從而為制備具有更好免疫效果的新城疫、禽流感二聯滅活疫苗提供依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗用抗原福州大北農生物技術有限公司生產的未濃縮的新城疫抗原、不同濃縮倍數的流感抗原。

1.1.2試驗用疫苗雞新城疫、禽流感 （H9N2 HP株）二聯滅活疫苗由福州大北農生物技術有限公司用試驗抗原乳化而成，批號：SY2015003。

1.1.3試驗用雞21日齡SPF雞40羽。SPF蛋由濟南斯帕法斯家禽有限公司提供，福州大北農生物技術有限公司自行孵化。

1.2試驗方法

1.2.1疫苗的制備使用生產中的新城疫和禽流感抗原，新城疫抗原為收獲的未濃縮的抗原，禽流感抗原為收獲的未濃縮的抗原、進行3倍濃縮的抗原、進行6倍濃縮的抗原。將新城疫抗原與各組禽流感抗原加入4%吐溫作為水相，按水相與油相比為1：3的比例，使用試驗型高速剪切機，將水相加入油相中進行剪切、乳化制成油包水劑型的單苗，然后將新城疫單苗與各組禽流感單苗等量混合均勻作為不同組的雞新城疫、禽流感二聯滅活疫苗；流感抗原未濃縮的疫苗樣品為A組，流感抗原3倍濃縮的疫苗樣品為B組，流感抗原6倍濃縮的疫苗樣品為C組。

1.2.2試驗分組SPF蛋進行孵化，出殼的雛雞由本公司自行養至21日齡。選擇健康有活力的雞40羽，隨機選10羽編為A組，免疫A組疫苗樣品；隨機選10羽編為B組，免疫B組疫苗樣品；隨機選10羽編為C組，免疫C組疫苗樣品；余10羽編為D組，為空白對照組。并對每羽雞打上翅標編號，試驗雞在免前、免后均在隔離器內喂養。

1.2.3免疫方法分別將A、B、C組新-流二聯滅活疫苗樣品免疫21日齡SPF雞，每羽頸部皮下注射0.3 mL；空白對照組均不免疫。

1.2.4抗體監測各免疫組與對照組均于20日齡（即免前）及免后7、14、21、28、35 d進行采血，檢測新城疫與禽流感抗體。

1.2.5抗體檢測方法抗體檢測應用紅細胞凝集抑制試驗的方法，具體步聚：用PBS將待檢血清做2倍系列稀釋，加入含4HAU血凝素抗原液，并設PBS 和4HAU血凝素抗原液對照，充分振搖后，置室溫下至少20 min或在2～8℃下40～60 min，再加入1%雞紅細胞懸液，置室溫20～40 min或置2～8℃ 下40～60 min，當紅細胞對照孔中的紅細胞呈顯著鈕扣狀時判定結果，以使紅細胞凝集被完全抑制的血清最高稀釋度作為判定終點。

2　結　果

從新城疫、禽流感抗體監測結果可以看出（見表1、圖1-圖2），對照組新城疫、禽流感抗體在各日齡均為陰性，免疫組新城疫、禽流感抗體均從免后7 d開始迅速上升，免后21 d上升至峰值，然后開始逐漸下降。由于各免疫組疫苗的新城疫抗原含量一樣，所以，免后各時間的抗體基本一致。而不同組的流感抗原含量不一樣，免后14 d、21 d的抗體有較大的差別，濃縮倍數越高，兩個時間段的抗體值越高；免后28 d及以后，各組流感抗體又非常接近。

表1　新城疫、禽流感抗體水平監測結果

3　結論與討論

1）目前市場上對新城疫、禽流感疫苗的免疫效果評價不一，與各廠家疫苗的質量有一定的關系。各廠家疫苗中所含的抗原病毒含量有較大的差異，有的廠家抗原效價低，有的抗原效價高，部分廠家的抗原進行了不同倍數的濃縮。本試驗免疫不同濃縮倍數流感抗原制備的疫苗后，抗體水平結果可以反映不同組疫苗免疫效果的確有一定的差別。在鄭世蘭等［8］的研究中提到，提高單位體積的抗原含量是聯苗生產的技術關鍵，而抗原濃縮是達到此目的的理想辦法；在張健等［9］的研究也說明這一點，生產雞用聯苗尤其是生產四聯苗，單位體積內抗原含量是關鍵，而單純改變疫苗乳化工藝中的油水比例以及通過改變病毒增殖條件均不能達到多聯苗生產所需要的抗原含量。因此，尋求一種抗原濃縮的方法使每羽份疫苗中含有足夠的抗原，同時使免疫劑量盡量減小，是四聯苗生產中的重要一環。還有一些關于不同免疫劑量的免疫效果的研究也同樣說明疫苗中抗原病毒含量的重要性，如溫志芬等［10］研究結果顯示，0.5 mL/羽劑量的免疫效果比0.1 mL/羽和0.3 mL/羽劑量的免疫效果好，免疫劑量大表明注射到機體中的抗原含量也相對多，免疫效果更好。

2）新城疫、禽流感抗體的產生與抗原毒價（病毒含量）呈正相關，抗原毒價越高，抗體產生水平越高，持續期長［11］。因此，在生產中提升疫苗中的抗原病毒含量是關鍵，作為疫苗廠家可以通過不同的方法提升抗原的病毒含量，如通過抗原生產工藝改進來提升抗原的效價、通過抗原的濃縮提升抗原的病毒含量等。本試驗結果表明，禽流感早期抗體的產生與抗原的病毒含量呈正相關，在免疫后期抗體趨于一致。

3）目前，禽流感感染禽很大一部分在早期，如一個月內的小雞，甚至是10日齡左右的雛雞。而用現有滅活疫苗免疫后，產生抗體較緩慢，不能產生可保護的抗體水平，所以，在小日齡雞上免疫效果不佳。從本試驗結果可以看出，通過濃縮提升抗原病毒含量，免疫后14～21 d的抗體有相應的提升，有更好的免疫效果，但是從生產成本上核算，成本增加了不少，很多廠家難以接受。目前也有很多廠家在尋找更好的方法，如在疫苗中添加免疫增強劑來提升免疫效果，這也是一種很好的方法。趙占民等［12］、陸新浩等［13］在研究中提到，免疫增強劑是一類單獨使用或與抗原同時使用、通過非特異性途徑增強機體免疫應答的物質，可增強機體的免疫功能，緩解由環境造成的免疫功能紊亂，有利于預防和治療傳染性和條件性疾病。

［1］趙雪麗，李明義，范根成.禽流感（H5、H9亞型）二價油乳劑滅活疫苗試驗研究［J］.上海畜牧獸醫通訊，2005（2）：22-24.

［2］甘孟侯.禽流感［M］.2版.北京：中國農業出版社，2002：1-14.

［3］童海兵，張小榮，吳艷濤，等.H9N2亞型禽流感滅活疫苗的免疫效果評價［J］.中國家禽，2010，32（20）：243-244.

［4］韓建文.新城疫、禽流感（H5，H9亞型）油乳劑滅活疫苗中抗原含量與抗體關系的研究［D］.揚州：揚州大學，2007.

［5］趙君和.2016年禽流感的流行特點及防控策略［J］.中國畜牧獸醫文摘，2016，32（1）：2-3.

［6］唐秀英，田國斌，于康震，等.禽流感油乳劑滅活疫苗的研究［J］.中國預防獸醫學報，1999，21（6）：401-405.

［7］羅開健，辛朝安.禽流感油乳劑滅活疫苗的研制［J］.中國獸醫雜志，2001，37（7）：6-9.

［8］鄭世蘭，姜北宇，劉福致，等.用平板式超濾機濃縮雞新城疫及法氏囊病毒試驗效果觀察 ［J］.華北農學報，1999，14（2）：139-144.

［9］張健，王英珍，巴圖，等.禽用油乳劑滅活疫苗生產工藝改進---病毒濃縮試驗［J］.動物科學與動物醫學，2002，19（8）：29-30.

［10］溫志芬，陳瑞愛，唐滿華，等.禽流感H9亞型滅活油乳劑疫苗不同劑量的免疫效果比較［J］.中國獸醫科技，2003，33 （12）65-66.

［11］王春華.不同抗原含量和配苗比例的新城疫油乳劑滅活苗對雞免疫后抗體監測和攻毒試驗 ［J］.遼寧畜牧獸醫，2002（2）：26-27.

［12］趙占民，趙來兵，李全福，等.母源抗體對雞新城疫疫苗免疫的影響［J］.中國獸醫雜志，2004，40（3）：6-8.

［13］陸新浩，徐震宇，劉鴻，等.不同免疫增強劑對肉雞禽流感免疫效果的影響試驗［J］.浙江畜牧獸醫，2010（6）7-9.

Detection of antibodies against bivalent inactivated vaccines containing newcastle disease virus and unequal contents of avian influenza virus in SPF chickens

Jiang Xinghua1Zhao Huae1Lin Xiaorong1Bao Songying1Cui Longping1Wang Quanxi2*
（1.Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.，Fuzhou 350014；2.College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002）

21-day-old specific pathogen free（SPF）chickens were inoculated with three kinds of bivalent newcastle disease and avian influenza（H9N2 HP strain）inactivated vaccines，which contained original newcastle disease virus（NDV）and primal，three folds of concentration，six folds of concentration of avian influenza virus（AIV），respectively.Every chicken in immune group was inoculated with a dose of 0.3 mL，and simultaneously，chickens were mock inoculated as control group.In order to detection antibodies of NDV and AIV blood samples were collected from both immune group and control group before immunization and at 0，7，14，21，28 and 35 day postimmunization（dpi），respectively.Results showed that，the antibody levels against NDV in each immune groups were basically consistent at different timepoints of post-immunization，the antibody levels against AIV increased depending on the virus quantity at 14 and 21 dpi，and then decreased gradually till to non-difference.Overall，antibody levels against AIV could represent the immune effect of this bivalent inactivated vaccines after immunization，and the improvement of antibody levels and immune effect in early immunization might be obtained by means of increasing the amount of antigens.

Newcastle disease Avian influenza Unequal contents of virus Bivalent inactivated vaccines SPF chickens Antibody levels detection

A

1003-4331（2016）04-0022-03

福州市區域重大項目（2015-Q-29）資助。

江興華（1975-），男，高級獸醫師，碩士生校外導師。主要從事獸用疫苗的生產與研發，jxhgreen@163.com。
*

王全溪（1978-），男，副教授，博士研究生，碩士生導師。研究方向為宿主與病原互作，wqx608@126.com。