基于HPLC-MS技術的黃顙魚中不同部位脂質成分分析

楊　怡，徐盼盼，宋　悅，陳娟娟，楊　銳

(寧波大學　應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江　寧波　315211)

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基于HPLC-MS技術的黃顙魚中不同部位脂質成分分析

楊怡，徐盼盼，宋悅，陳娟娟*，楊銳

(寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江寧波315211)

利用超高效液相色譜-飛行時間質譜技術(UPLC-Q-TOF-MS/MS)分析了黃顙魚不同部位的脂質成分。采用甲醇-氯仿(1∶1，體積比)對血清、肌肉和肝臟進行脂質成分提取。液相色譜采用C8色譜柱，柱溫40 ℃，流動相A為乙腈-甲醇-異丙醇(1∶1∶1)，流動相B為乙腈-水(0.1% 甲酸，0.01%氯化鋰)。根據高分辨質譜獲得精確分子量，推測出元素組成，并結合脂質成分的二級質譜裂解規律，在血清、肌肉和肝臟中共鑒定出85個脂質成分，主要有PC，Lyso-PC，PE，Lyso-PE，PI，PS，DAG，TAG，SM和Cer。在這3個部位中有19個共有脂質成分，包括Lyso-PC 16∶0,9個 PC,3個 PI,4個TAG和2個SM。此外 PS和Lyso-PE僅在肌肉中鑒定出，分別為PS 18∶0/22∶6,Lyso-PE 16∶0和Lyso-PE 18∶1；神經酰胺僅在肝臟中觀察到，為Cer(d18∶1/24∶1)；而PE和DAG只在肌肉和肝臟中存在，在血清中未發現。該方法操作簡單、靈敏、高效，為快速、全面了解黃顙魚中的脂質分布提供了科學依據。

黃顙魚；超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)；脂質成分

黃顙魚(Pelteoobagrusfulvidraco)俗稱嘎牙子、黃姑、黃臘丁、黃鰭魚等，屬鯰形目(Siluriformes)鮠科(Bagridae)黃顙魚屬(Pelteobagrus)，是廣泛分布于長江、黃河、珠江等流域的小型雜食性經濟淡水魚類。該魚肉質細嫩、少細刺、味道鮮美、無鱗片，且營養豐富，藥用價值高，因而成為備受人們喜愛的優質食用魚[1-2]。隨著淡水漁業的不斷發展，人們對黃顙魚的市場需求量日益增加，有關提高黃顙魚整體養殖質量的方法也成為研究熱點[3]。脂肪是魚類最佳的能量來源，用于魚體增重和分解供能的脂肪總利用率達90%以上[4-5]。由于脂肪的重要性，導致在魚類養殖過程中使用添加了脂肪的飼料[6-7]。但魚體內脂肪積累過載，會導致可食部分減少或者食用價值下降，甚至引起脂肪肝[8]。因此,了解黃顙魚體內各部位的脂質成分，可為進一步研究黃顙魚的養殖和食用等提供基本數據，對研究魚類配合飼料及提高魚類品質具有重要的指導意義[9-10]。

目前對于黃顙魚中脂質成分的研究基本未見報道。魚類脂質成分的研究手段中[11-14]，色譜-質譜聯用方法與其他分析方法相比[15-17]，兼具色譜的高分離度、高通量及質譜的普適性、高靈敏度和特異性，成為有效成分研究中使用最廣泛的分析手段[14,18-21]。本文以超高效液相色譜-飛行時間質譜為分析手段，對黃顙魚中血清、肝臟和肌肉3個部位的脂質成分進行研究，通過其質譜裂解途徑，鑒定其中含有的脂質成分種類，并比較了3個部位脂質成分的差異性。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

ACQUITY 超高效液相色譜分析系統(配 ACQUITY 自動進樣器以及Q-TOF Premier 高分辨四極桿與飛行時間串聯質譜儀)，ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，MassLynx 4.1 數據處理系統均購于美國 Waters 公司；國產SB5200DT 超聲波清洗機；瑞士Mettler Toledo XS105分析天平；3-8K臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；超純水系統(美國PALL公司)。

甲醇、乙腈、異丙醇、甲酸、氯化鋰(色譜純,美國 Sigma-Aldrich 公司)。

1.2黃顙魚脂質成分提取

試驗用黃顙魚幼魚購自浙江嘉興一星公司養殖基地，實驗前禁食24 h后取健康、體重相近的黃顙魚幼魚進行分組。將其中300尾隨機分為對照組與試驗組，每組5個重復，每個重復30尾魚，以每個重復(30尾魚)為單位分別飼養于500 L圓柱形藍色塑料桶中。對照組飼喂普通飼料，試驗組飼喂在普通飼料中添加0.1%自提褐藻糖膠的飼料，試驗期為8周。8周后取黃顙魚的血清、肝臟和肌肉，經超低溫冷凍干燥后，液氮冰浴研磨，保存于-80 ℃，備用。

取適量樣品(肝臟25 mg，肌肉50 mg和血清500 μL)于15 mL玻璃離心管中，加入5 mL甲醇-氯仿(1∶1)振蕩5 min，超聲10 min(超聲波中的水應浸沒管中液面)，3 500 r/min離心10 min后取上清液于旋蒸瓶，以上操作重復3次，合并上清液，于27 ℃旋蒸至恒重；加1 mL甲醇沖洗旋蒸瓶，重復2次，將洗好的溶液轉移1.6 mL至4 mL樣品瓶中，27 ℃旋蒸，氮氣吹干；以500 μL甲醇分兩次復溶后，12 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜至2 mL進樣瓶。從2 mL樣品瓶中取200 μL肌肉提取液，用甲醇稀釋至800 μL；各取100 μL肝臟和血液提取液，用甲醇分別稀釋至800 μL，上機分析。

1.3超高效液相色譜-飛行時間質譜分析條件

1.3.1色譜條件Waters Acquity UPLCTMBEH C8色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×10 mm)，柱溫40 ℃。流動相：A為乙腈-四氫呋喃-異丙醇(1∶1∶1)，B為乙腈-水(2∶1)，流動相A和流動相B中均加入0.1%甲酸和0.01%氯化鋰。梯度洗脫條件：0～3 min，2%A，3～5 min，2%～30%A，5～12 min，30%～50%A，12～22 min，50%～80%A，22～25 min，80%A，25～27 min，80%～2%A，27～30 min，2%A。流速：0.5 mL/min；進樣量：3 μL。

1.3.2質譜條件質譜采用電噴霧電離源(ESI)，離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度250 ℃，脫溶劑氮氣流速600 L/h。負離子電離模式下，毛細管電離電壓2.6 kV，取樣錐孔電壓45 V；正離子電離模式下，毛細管電離電壓3.0 kV，取樣錐孔電壓35 V。質量掃描范圍m/z100～1 200，一次掃描時間為0.3 s。在MSE模式下碰撞能量在低能量(25 V)和高能量(45 V)間轉換，串聯二級質譜模式(MS/MS)下碰撞能量為25～65 V 。TOF離子飛行方式采用V模式，使用0.5 ng/μL亮腦啡肽作為外標物對目標離子進行精確質量鎖定。

2　結果與討論

2.1黃顙魚的超高效液相色譜-飛行時間質譜分析

分別取黃顙魚肝臟50 mg、肌肉25 mg和血清500 μL，按照“1.2”方法進行提取，吹干并用500 μL甲醇復溶。由于不同組分中的脂質含量差距較大，為在質譜中獲得最佳譜圖，避免出現過濃現象，需對復溶后的樣品進行稀釋。經過多次實驗，最終確定肌肉樣品稀釋4倍，肝臟不稀釋，血液稀釋8倍，再進行超高效液相色譜-飛行時間質譜分析。

參照文獻[22]，確定以Waters Acquity UPLCTMBEH C8為色譜柱，但所采用的有機流動相導致脂質成分易形成[M+Na]+離子，因此在流動相中添加0.01%氯化鋰，從而在正離子模式下獲得[M+Li]+，使其在高能量下出現較多的二級碎片離子。此外，由于脂質成分種類繁多，在質譜正離子模式和負離子模式下出峰情況不同，因此分別采用正、負離子模式，并結合MSE模式，選擇碰撞能量在低能量(25 V)和高能量(45 V)間轉換分析，同時獲得脂質成分的一級和二級質譜圖。黃顙魚肝臟、肌肉和血清中的脂質成分在正、負離子模式下的總離子流圖如圖1所示，由圖可知，三者的質譜總離子流圖差異較大，表明3個部位的脂質成分分布有較大差異。

2.2脂質成分鑒定

如圖1所示，在0～18 min的分析時間內，3個部位的總離子流圖出現了大量的脂質信號峰，根據高分辨質譜的準分子離子峰以及二級質譜數據對各脂質的信號峰進行分析。由于信號峰較多，因此本文只針對Lipidmap數據庫收集的脂質成分進行結構鑒定，不屬于脂質成分的信號峰則不進行結構鑒定。在負離子電噴霧模式下，Lysophosphatidylethanolamine(Lyso-PE),Phosphatidylethanolamine(PE)，Phosphatidylinositol(PI)和Phosphatidylserine(PS)主要形成[M-H]-，Lysophosphatidylcholines(Lyso-PC) ,Phosphatidylcholines(PC)主要形成[M+HCOO]-。PE的 [M-H]-產生特征碎片離子m/z140 [C2H7P4NP]-,m/z196 [C5H11O5NP]-以及相應的羧酸陰離子[R1COO]-和[R2COO]-；PI的 [M-H]-產生特征碎片離子m/z241 [C6H10O8P]-,子離子m/z153 [C3H6O5P]-、羧酸陰離子[R1COO]-和[R2COO]-；PS的[M-H]-通過極性頭部基團C3H5O2N中性丟失產生碎片離子[M-H-87]-；負離子模式下，PC形成大量的[M+HCOO]-負離子分子，失去CH3COOH(60 Da)后產生碎片離子[M-CH3]-，進一步裂解產生特征碎片離子m/z168 [C4H11O4NP]-以及sn-1和sn-2位羧酸陰離子[R1COO]-和[R2COO]-。

在正離子電噴霧模式下，PC，Triradylglycerols(TAG)，Diradylglycerols(DAG)，Sphingomyelin(SM)和Ceramides(Cer)主要形成[M+Li]+。PC形成[M+H]+和[M+Li]+，分子離子[M+H]+的頭部極性基團斷裂形成帶電碎片m/z184 [C5H15O4NP]+，而分子離子[M+Li]+的頭部極性基團丟失C3H9N(59 Da)產生碎片離子[M+Li-59]+，進而又丟失C2H5O4P(124 Da)產生碎片離子[M+Li-59-124]+，碎片離子[M+Li-59]+裂解又產生[M+Li-59-R1COOH]+和[M+Li-59-R2COOH]+碎片；TAG的正分子離子[M+Li]+裂解產生[RnCO-18]+，[RnCO]+，[R2CH=CHCOOH+Li]+，[RnCOOH+Li]+，[M+Li-RnCOOH-R2CH=CHCOOH]+，[M+Li-RnCOOLi]+和[M+Li-RnCOOH]+碎片離子，從而可對TAG定性分析；DAG的正分子離子為[M+Li]+，其裂解碎片規律與TAG相同；而Cer的分子離子[M+Li]+裂解產生大量碎片離子，主要為代表LCB鏈的碎片離子、酰胺基鏈碎片離子；SM的分子離子[M+H]+的頭部極性基團斷裂形成帶電碎片m/z184 [C5H15O4NP]+，而分子離子[M+Li]+的裂解機制與Cer相同，其碎片離子主要有代表LCB鏈和酰胺基鏈的離子，但因PC也產生碎片離子m/z184，因此根據氮規則來排除PC(PC的質子化分子m/z值為偶數，而SM的質子化分子m/z值為奇數)，再結合精確分子量鎖定來分析化合物的元素組成，最終確定為SM。因此根據這些特征碎片離子，在正、負離子模式下共鑒定出85個脂質成分(見表1)。

表1　黃顙魚不同部位的脂質成分信息

(續表1)

a：detected;b：no detected

2.3不同部位脂質成分的比較分析

由表1可知，共鑒定出85種脂質成分，主要有PC，Lyso-PC，PE，Lyso-PE，PI，PS，DAG，TAG，SM和Cer 10類脂質成分。PC作為細胞膜成分中的主要磷脂之一，在真核細胞膜磷脂中的含量占40%～60%，在細胞結構和生物功能方面起重要作用；PC在動物的肝臟中含量較多，結合表1可知，在黃顙魚3個部位中，肝臟中所含的PC種類最多，共有21種。TAG是糖脂類的一個分支，是能量存貯的主要單元，具有積蓄脂肪酸的功能，且是磷脂合成的前體物。由于這些主要功能，在黃顙魚各部位中，PC，Lyso-PC和TAG是主要脂質成分。此外，PI對于維持細胞形態、代謝調控和信號傳導等各種生理過程均發揮重要作用；PS是細胞膜的活性物質，主要存在于大腦細胞，因此在血清、肝臟和肌肉中僅發現1個PS成分。在細胞膜磷脂成分中，PE的含量僅次于PC。DAG是脂質生物合成的中間產物。Cer是鞘脂類的中間代謝產物，其在生物合成上占有重要位置。鞘磷脂存在于大多數哺乳動物細胞的質膜內，是髓鞘的主要成分。但這些成分在各部位的分布不同，其中PS和Lyso-PE僅在肌肉中鑒定出，分別為PS 18∶0/22∶6,Lyso-PE 16∶0和Lyso-PE 18∶1；神經酰胺僅在肝臟中觀察到，為Cer(d18∶1/24∶1)；而PE和DAG只在肌肉和肝臟中存在，在血清中并未檢出。

對血清、肝臟和肌肉中上述85個脂質成分進行分組分析(如圖2)，可以明顯觀察到，血清中鑒定出37個脂質成分，肝臟中分析出49個脂質成分，肌肉中的脂質成分最多，共有59個。 3個部位共同存在的脂質成分有19個，主要為Lyso-PC 16∶0，9個PC(PC 16∶0/16∶0,PC 18∶1/16∶0,PC 18∶2/16∶0,PC 18∶2/18∶2，PC 20∶1/16∶0,PC 20∶2/16∶0,PC 20∶3/16∶0，PC 22∶6/ 16∶0和 PC 22∶6/18∶2)，3個PI(PI 18∶0/20∶5,PI 18∶0/20∶4和 PI 18∶1/20∶4)，4個TAG(TAG 18∶1/14∶0/18∶2，TAG 18∶1/18∶1/16∶0，TAG 18∶1/18∶1/18∶1和TAG 18∶2/18∶2/18∶1)和2個SM(SM(d18∶1/22∶0)和SM(d18∶1/24∶1))。血清、肝臟和肌肉共有的PC和Lyso-PC脂質成分中大都含有C16∶0脂肪酸鏈。

而肌肉與肝臟兩個部位的共有脂質成分有29個，除去上述3個部位共有的19個化合物，還有10個脂質成分在肌肉和肝臟中共同存在，主要為PC，PE，TAG以及兩個部位中特有的DAG；血清與肌肉中共有的脂質成分有24個，除去3個部位共有的19個化合物，還有5個脂質成分在血清與肌肉中共同存在，主要為Lyso-PC，PI和TAG；血清與肝臟共有的脂質成分有26個，除去3個部位共有的19個化合物，還有7個脂質成分在血清與肝臟中共同存在，主要為Lyso-PC，PC和SM。

3　結　論

本文對黃顙魚的血清、肌肉和肝臟中的脂質提取物進行超高效液相色譜-飛行時間質譜分析。利用高分辨質譜的碎裂途徑，共鑒定出85種脂質成分，包括10類脂質組成：PC，Lyso-PC，PE，Lyso-PE，PI，PS，DAG，TAG，SM和Cer。其中在血清中鑒定出37個脂質成分，肝臟中分析出49個脂質成分，肌肉中的脂質成分最多，有59個。血清、肌肉和肝臟的脂質成分分布不同,其中3個部位共有脂質成分為19個，PS和Lyso-PE僅在肌肉中鑒出，分別為PS 18∶0/22∶6,Lyso-PE 16∶0和Lyso-PE 18∶1；神經酰胺Cer(d18∶1/24∶1)僅在肝臟中觀察到；而PE和DAG只在肌肉和肝臟中存在。本研究快速、高效、全面地分析了黃顙魚不同部位的脂質分布，為魚類品質研究提供了科學依據。

致謝：感謝寧波大學海洋學院周歧存教授提供黃顙魚作為實驗材料。

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Analysis on Lipids in Different Parts of Pelteoobagrus fulvidraco by Ultra-performance Liquid Chromatography Coupled with Mass Spectrometry

YANG Yi,XU Pan-pan,SONG Yue,CHEN Juan-juan*,YANG Rui

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education,Ningbo University，Ningbo 315211,China)

An analytical method for the qualitative analysis of lipids in different parts ofPelteoobagrusfulvidracowas developed by ultra-performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF-MS/MS).The dried tissue and serum were extracted with methanol-chloroform(1∶1).The separation of extract was performed on a C8analytical column(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),using methanol-acetonitrile-isopropanol(1∶1∶1)(A) and acetonitrile-water(B) as mobile phases.Both A and B contained 0.1% formic acid and 0.01%sodium formate.The analysis of lipids was performed in positive and negative ionization modes.Under the optimized condition,mass-to-charge values of each lipid were obtained by high-resolution mass spectrometry,and the elemental composition could be evaluated.Based on the fragmentation pathways and characteristic fragment ions of lipids,totally 85 lipids were identified in serum,muscle and liver,which contain ten classes:phosphatidylcholines(PC),lysophosphatidylcholines(Lyso-PC),phosphatidylethanolamine(PE),lysophosphatidylethanolamine(Lyso-PE),phosphatidylinositol(PI),phosphatidylserine(PS),diradylglycerols(DAG),triradylglycerols(TAG),sphingomyelin(SM) and ceramides(Cer).There were 19 lipids,including Lyso-PC 16∶0,nine PCs,three PIs,four TAGs and two SMs found in muscle,liver and serum.While PS and Lyso-PE were only observed in muscle,such as PS 18∶0/22∶6,Lyso-PE 16∶0 and Lyso-PE 18∶1.Ceramides was identified in the extracts of liver tissue.PE and DAG were identified in the muscle and liver tissue.The method was demonstrated to be simple,sensitive and rapid,and was suitable for the analysis of lipid in different parts ofPelteoobagrusfulvidraco.

Pelteoobagrusfulvidraco；ultra-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry(UPLC-MS)；lipids

2015-11-20；

2016-01-13

浙江省自然科學基金(LQ13B050004)；寧波市自然科學基金(2015A610266)；浙江省水產重中之重學科開放基金(xkzsc1414，xkzsc1509)；寧波大學王寬誠幸福基金

陳娟娟，博士，副教授,研究方向：分析化學，Tel：0574-87609581，E-mail:chenjuanjuan@nbu.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.002

O657.63；O623

A

1004-4957(2016)07-0785-07