基于氮摻雜多孔碳的乙酰膽堿酯酶傳感器檢測殘留農(nóng)藥甲拌磷

吳建宏，呂冰婧，衛(wèi)　偉*

(1.華東石油技師學(xué)院，江蘇　揚(yáng)州　225129；2.東南大學(xué)　化學(xué)化工學(xué)院，江蘇　 南京　211189)

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基于氮摻雜多孔碳的乙酰膽堿酯酶傳感器檢測殘留農(nóng)藥甲拌磷

吳建宏1，呂冰婧2，衛(wèi)偉2*

(1.華東石油技師學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225129；2.東南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京211189)

以制備的新型氮摻雜多孔碳為載體，玻碳電極(GC)為工作電極，構(gòu)建了乙酰膽堿酯酶(AChE)傳感器，用于有機(jī)磷農(nóng)藥甲拌磷的檢測研究。在1.0 mmol/L底物氯化乙酰膽堿溶液中的差分脈沖掃描結(jié)果表明，AChE/GC電極上的峰電流為0.195 8 μA，而AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極上的峰電流為0.841 4 μA，說明氮摻雜多孔碳材料可有效固定AChE，提高檢測靈敏度。采用AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極對不同濃度甲拌磷進(jìn)行測定，在6.0×10-10～1.2×10-6g/L濃度范圍內(nèi)，抑制率與甲拌磷濃度的負(fù)對數(shù)呈良好的線性關(guān)系(r2=0.998 5)。按照抑制率為10%計(jì)算，檢出限為5.8×10-12g/L。采用加標(biāo)回收法檢測菠菜汁樣品中的甲拌磷，回收率為91.7%～97.4%。

甲拌磷；氮摻雜多孔碳；乙酰膽堿酯酶；氯化乙酰膽堿

甲拌磷屬于內(nèi)吸性有機(jī)磷殺蟲劑，因高效、低價(jià)而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。近年來的大規(guī)模過量和不規(guī)范使用，導(dǎo)致甲拌磷在環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中的殘留量日益增加[1]。環(huán)境中殘留的甲拌磷可被氧化成更高毒性的氧化物，具有較長的殘效期，對人類健康造成潛在威脅。殘留在農(nóng)產(chǎn)品中的甲拌磷可通過食物鏈進(jìn)入人體，在體內(nèi)抑制膽堿酯酶活性，造成神經(jīng)生理功能紊亂，短期內(nèi)接觸或大量接觸會引起急性中毒，嚴(yán)重時(shí)將出現(xiàn)肺水腫、腦水腫、昏迷、呼吸麻痹等癥狀，甚至導(dǎo)致遲發(fā)性猝死。因此，對甲拌磷殘留進(jìn)行檢測具有重要意義。

檢測甲拌磷的常用方法有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等，這些方法的選擇性、準(zhǔn)確度和靈敏度較高，但所需儀器設(shè)備昂貴，檢測周期較長，不適合現(xiàn)場快速檢測[2-3]。基于乙酰膽堿酯酶(AChE)傳感器的電化學(xué)方法具有簡單、快速、便攜等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一[4-6]。其中，如何選擇酶固定材料和提高檢測靈敏度，是AChE傳感器制備中需要解決的關(guān)鍵問題。由于具有大的比表面積、強(qiáng)的吸附能力、良好的導(dǎo)電性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，許多碳納米材料如碳納米管[7-8]、碳球[9]、碳?xì)饽z[10]等被廣泛用于構(gòu)筑AChE傳感器，以保護(hù)和提高酶的活性，達(dá)到提高檢測靈敏度的目的。然而，純碳材料的親水性較差，在一定程度上限制了其應(yīng)用。氮原子在元素周期表中處于碳原子相鄰位置，可取代碳材料中的碳原子。研究表明，在碳納米材料中摻雜氮原子可以極大地改變材料的表面結(jié)構(gòu)、調(diào)控其孔道結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)其親水性、改善材料的電子傳輸速率，從而擴(kuò)大碳納米材料在電化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)基于多孔碳材料的高導(dǎo)電性、良好生物相容性及大比表面積等優(yōu)點(diǎn)[13]，通過摻雜氮原子對多孔碳材料進(jìn)行功能化，強(qiáng)化多孔碳材料固有的優(yōu)異性能并賦予其新功能，用于制備AChE傳感器并進(jìn)行甲拌磷的電化學(xué)檢測研究。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

氯化乙酰膽堿(ATCl)和乙酰膽堿酯酶(C3389型)購于Sigma公司，甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(分析純)購于中國藥品生物制品檢定所。實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

CHI-660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，三電極體系:玻碳電極(GC)為工作電極，鉑電極為對電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極。

1.2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1氮摻雜多孔碳材料的制備氮摻雜多孔碳材料的制備采用離子液體1-丁基-三甲基咪唑二氰胺鹽(BMIMdca)為前驅(qū)體，二氧化硅球?yàn)橛材０濉Ｊ紫龋捎肧t?ber法制備直徑約300 nm的二氧化硅球。分別取1.0 g二氧化硅球和1.0 g BMIMdca離子液體加入50 mL水中，超聲分散30 min，室溫下攪拌4 h。混合物加熱至100 ℃除去水，產(chǎn)物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行炭化處理，以10 ℃/min升溫至800 ℃，保持3 h，然后采用10% HF溶液除去二氧化硅模板。經(jīng)過濾、洗滌、80 ℃干燥12 h后，獲得氮摻雜多孔碳[14]。

1.2.2AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器的制備GC電極依次用無水乙醇、二次蒸餾水超聲清洗，晾干后使用。用移液槍移取6 μL的120 U/mL AChE-0.50%戊二醛-1%牛血清蛋白混合液(1∶1∶1)于離心管中，再移取5 μL、1 mg/mL氮摻雜多孔碳材料，在渦流振蕩器上混勻后，滴加在GC電極上，室溫下晾干，即制得AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器。

2　結(jié)果與討論

2.1AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器的電化學(xué)表征

考察了裸GC電極、氮摻雜多孔碳/GC電極和AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極在10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(含0.10 mol/L KCl)溶液中的交流阻抗譜圖(見圖1)。如圖所示，裸GC電極的電阻約為120 Ω，氮摻雜多孔碳修飾后的GC電極電阻為33 Ω，說明氮摻雜多孔碳材料具有較高的電催化活性，可以加快電極表面的電子轉(zhuǎn)移。其中AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極的電阻最大(約為240 Ω)。這是因?yàn)锳ChE為非導(dǎo)電物質(zhì)，可以阻礙電子轉(zhuǎn)移，而電阻的增大表明酶已被很好地固定在電極上。

2.2底物氯化乙酰膽堿在不同電極上的電化學(xué)行為

采用差分脈沖法考察了不同電極在1.0 mmol/L ATCl底物溶液中的響應(yīng)信號(見圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AChE/GC電極上的峰電流為0.195 8 μA，AChE/多孔碳/GC電極上的峰電流為0.290 5 μA，AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極上的峰電流為0.841 4 μA。與AChE/GC電極相比，經(jīng)多孔碳和氮摻雜多孔碳固定AChE后，氧化峰電流值分別增加了48.37%和329.72%。由此可知，采用多孔碳和氮摻雜多孔碳固定AChE均可以提高AChE的酶活性，增大電流響應(yīng)信號。而且采用多孔碳材料中摻雜氮原子可以極大地改變材料的表面結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)親水性，改善材料的電子傳輸速率，從而使其具有更高的電催化活性，更大程度地提高檢測靈敏度。

分別在濃度范圍為0.005～2 mmol/L 的底物ATCl溶液中，掃描了AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極的時(shí)間～電流曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初始隨著底物濃度的增大，反應(yīng)速率逐漸增大，電流響應(yīng)值增加明顯，表明AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器對底物ATCl有很大的親和力及催化活性。隨著底物濃度繼續(xù)增大，反應(yīng)速率增大的趨勢逐漸減緩，說明傳感器上底物ATCl的濃度已飽和。底物濃度(C,mmol/L)分別在0.05～0.55 mmol/L和0.6～1.0 mmol/L范圍內(nèi)與峰電流(Ip,μA)呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為Ip=0.434 2C+0.076 9(r2=0.987 4)；Ip=0.160 7C+0.224 3(r2=0.981 6)。

2.3甲拌磷農(nóng)藥的檢測

底物氯化乙酰膽堿在乙酰膽堿酯酶的催化作用下水解產(chǎn)生乙酸和膽堿。而膽堿在電極表面能夠發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生電流響應(yīng)。甲拌磷可與乙酰膽堿酯酶形成非共價(jià)鍵中間復(fù)合物，即磷酰化膽堿酯酶，從而抑制酶活性，阻礙氯化乙酰膽堿水解，進(jìn)而降低產(chǎn)物膽堿的氧化峰電流，且峰電流下降的程度與甲拌磷對酶的抑制程度相關(guān)，因此可通過抑制率變化檢測甲拌磷的含量。對甲拌磷抑制前后的AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極進(jìn)行差分脈沖掃描，結(jié)果顯示，未加入甲拌磷時(shí)，電極上產(chǎn)生的氧化峰電流為0.841 4 μA，加入6.0×10-7g/L甲拌磷抑制后，電極上產(chǎn)生的氧化峰電流降為0.388 9 μA。根據(jù)抑制率計(jì)算公式A=[(I0-I)/I0]×100%(式中A為抑制率,I0為未加甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)的峰電流值,I為加入甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)溶液抑制后的峰電流值)，得到抑制率為53.77%。

在1.0 mmol/L的ATCl溶液中加入6.0×10-7g/L甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)溶液后，每隔2 min進(jìn)行差分脈沖伏安法掃描，考察甲拌磷對酶的最佳抑制時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著抑制時(shí)間的增加，抑制率逐漸增大，當(dāng)抑制時(shí)間達(dá)10 min后，增幅相對平緩。所以選擇10 min作為最佳抑制時(shí)間。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極，在6.0×10-13～1.2×10-5g/L濃度范圍內(nèi)加入不同濃度的甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，10 min后進(jìn)行差分脈沖伏安法掃描，計(jì)算甲拌磷的抑制率，作濃度負(fù)對數(shù)與抑制率的關(guān)系曲線圖。結(jié)果表明，抑制率隨其濃度的增加而增加，在6.0×10-10～1.2×10-6g/L濃度范圍內(nèi)，抑制率(A)與甲拌磷濃度(X,g/L)的負(fù)對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為A(%)=-9.089 7X+112.106 8,r2=0.998 5。按照抑制率為10%進(jìn)行計(jì)算，得到檢出限為5.8×10-12g/L。

2.5實(shí)際樣品的檢測

制備菠菜汁空白樣品，采用加標(biāo)回收法，分別加入9.6×10-8，9.6×10-7g/L的甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，用AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器檢測樣品的回收率。測得樣品的回收率為91.7%～97.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于11.5%。相比于其他檢測方法[15-16]，本方法的靈敏度更高，檢測范圍更寬，具有良好的應(yīng)用前景。

3　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)通過制備氮摻雜多孔碳材料固定AChE，構(gòu)建了AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器用于農(nóng)藥殘留甲拌磷的檢測研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氮摻雜多孔碳材料可以有效固定AChE，提高甲拌磷的檢測靈敏度。在6.0×10-10～1.2×10-6g/L濃度范圍內(nèi)，抑制率與甲拌磷濃度的負(fù)對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為5.8×10-12g/L。菠菜汁樣品的加標(biāo)回收率為91.7%～97.4%。該方法操作方便、快速，具有較強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)適用性。

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Detection of Phorate Using Acetylcholinesterase Biosensor Based on Nitrogen-doped Porous Carbon

WU Jian-hong1,Lü Bing-jing2,WEI Wei2*

(1.East China Petroleum Technician College，Yangzhou225129,China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering,Southeast University,Nanjing211189,China)

Nitrogen-doped porous carbon was used to immobilize acetylcholinesterase(AChE) to fabricate biosensor for the detection of organophosphorus pesticide phorate.The peak current was 0.195 8 μA at the AChE/GC electrode,while 0.841 4 μA was obtained at AChE/nitrogen-doped porous carbon/GC electrode,indicating that nitrogen-doped porous carbon can effectively immobilize AChE and enhance the sensitivity.The inhibition rate versus logarithm of phorate were linear in the range of 6.0×10-10-1.2×10-6g/L,with a correlation coefficient(r2) of 0.998 5.The detection limit of phorate,calculated by inhibition rate of 10%,was 5.8×10-12g/L.The sensor could be used for the detection of phorate in spinach juice with recoveries of 91.7%-97.4%.

phorate；nitrogen-doped porous carbon；acetylcholinesterase；acetylcholine

2016-03-09；

2016-03-16

國家自然科學(xué)基金(21475020)

衛(wèi)偉，博士，教授，研究方向：分析化學(xué)，Tel：025-52090613，E-mail：wei_wei98@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.022

O657.1；F767.2

A

1004-4957(2016)07-0897-04