全身應(yīng)用催產(chǎn)素對骨質(zhì)疏松大鼠種植體骨結(jié)合的影響

王買全　彭利偉　李運峰

1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院口腔科，鄭州 450003；2.口腔疾病研究國家重點實驗室　華西口腔醫(yī)院正頜與關(guān)節(jié)外科（四川大學(xué)），成都 610041

·基礎(chǔ)研究·

全身應(yīng)用催產(chǎn)素對骨質(zhì)疏松大鼠種植體骨結(jié)合的影響

王買全1彭利偉1李運峰2

1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院口腔科，鄭州 450003；2.口腔疾病研究國家重點實驗室華西口腔醫(yī)院正頜與關(guān)節(jié)外科（四川大學(xué)），成都 610041

目的探討骨質(zhì)疏松大鼠全身應(yīng)用催產(chǎn)素對種植體骨結(jié)合的影響。方法20只大鼠平均分成對照組和實驗組，接受雙側(cè)卵巢切除術(shù)以建立骨質(zhì)疏松模型。12周后，在每只大鼠的雙側(cè)股骨遠中干骺端各植入1枚種植體，同時接受催產(chǎn)素全身用藥，實驗組皮下注射催產(chǎn)素（每天1 mg·kg-1），對照組注射生理鹽水。用藥4周后，觀察8周，手術(shù)取出大鼠脛骨和帶有種植體的股骨，采用顯微CT和組織學(xué)染色觀察大鼠脛骨的骨質(zhì)疏松情況，用顯微CT、組織學(xué)觀察和推出試驗評價骨結(jié)合效果。結(jié)果實驗組與對照組相比，脛骨樣本的骨小梁增多、密集，交織成網(wǎng)狀，骨質(zhì)疏松模型成功建立。實驗組種植體周圍的相對骨體積分數(shù)為0.35%±0.06%，骨結(jié)合率為67.25%±9.06%，最大推出力為（70.32±10.91） N，對照組的相對骨體積分數(shù)、骨結(jié)合率和最大推出力分別為0.11%±0.02%、43.25%±7.01%、（21.65±4.36） N，實驗組較對照組均明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論全身應(yīng)用催產(chǎn)素可拮抗骨質(zhì)疏松的負面影響，促進種植體愈合，對純鈦種植體的骨結(jié)合具有正向影響。

催產(chǎn)素；種植體；骨質(zhì)疏松；骨結(jié)合

目前種植修復(fù)是治療各種牙齒缺失的主要手段之一，但是種植區(qū)骨量不足是臨床上種植手術(shù)經(jīng)常面臨的主要問題，其中骨質(zhì)疏松是公認的牙種植的重要危險因素之一［1］。研究［2］發(fā)現(xiàn)，人的成骨細胞和破骨細胞上均存在催產(chǎn)素受體，一些與骨質(zhì)疏松相關(guān)的病理或生理過程中常伴有催產(chǎn)素水平的改變。Dursun等［3］提出了催產(chǎn)素可能與骨質(zhì)疏松相關(guān)的推測，認為催產(chǎn)素能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化［4］，并可促進成骨細胞的增殖，增強其骨形成功能。頜骨的骨質(zhì)和骨量是骨內(nèi)種植體成功的基礎(chǔ)，生理性或病理性的骨質(zhì)疏松會使骨內(nèi)種植體的初期和長期穩(wěn)定性受到威脅［5］。由此可以設(shè)想，催產(chǎn)素有可能為臨床上需要種植牙齒的絕經(jīng)后婦女提供幫助，提高種植牙成功率；但是將催產(chǎn)素應(yīng)用于口腔種植領(lǐng)域，增加骨質(zhì)疏松患者種植體周圍骨量的研究，目前卻鮮有報道。

本實驗通過建立大鼠骨質(zhì)疏松動物模型，全身給予皮下注射催產(chǎn)素，探討骨質(zhì)疏松時應(yīng)用催產(chǎn)素對種植體骨結(jié)合的影響。

1　材料和方法

1.1實驗動物和材料

3月齡雌性SD大鼠20只（平均體重250 g），購自鄭州大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物中心。鈦種植體（種植體長度10 mm，直徑1 mm，四川大學(xué)生物材料測試中心提供），1%甲苯胺藍溶液（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），Y. Cheetah型顯微CT機（YXLON公司，德國）。

1.2大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立及種植體的植入

20只大鼠經(jīng)過1周的環(huán)境適應(yīng)后，均去除雙側(cè)卵巢［6］，觀察12周以建立骨質(zhì)疏松模型。12周后，在每只大鼠雙側(cè)股骨遠中干骺端各種植1枚種植體，具體步驟如下。用10%水合氯醛（3.3 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，雙側(cè)下肢備皮，術(shù)區(qū)消毒鋪巾，完成術(shù)前準備后于大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做長約2.5 cm切口，暴露髕骨以及膝關(guān)節(jié)囊，于髕骨內(nèi)側(cè)切開關(guān)節(jié)囊，暴露股骨膝關(guān)節(jié)面，生理鹽水沖洗降溫下于股骨膝關(guān)節(jié)面下方以裂鉆沿股骨橫軸方向鉆孔，直達髓腔，植入種植體，縫合軟組織，術(shù)后3 d每天給予青霉素40×104U·kg-1肌肉注射以預(yù)防感染。

1.3催產(chǎn)素處理

種植體植入術(shù)后3 d，20只大鼠平均分成對照組和實驗組，每組10只。實驗組大鼠皮下注射催產(chǎn)素（每天劑量為1 mg·kg-1）［7］，對照組注射生理鹽水，持續(xù)4周。20只大鼠在處理前均無死亡。處理后觀察8周，處死大鼠，取出大鼠雙側(cè)股骨和脛骨樣本。采用顯微CT和蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察大鼠脛骨的骨質(zhì)疏松情況。采用顯微CT、甲苯胺藍染色和推出試驗檢測大鼠股骨上種植體的骨結(jié)合情況。

1.4種植體骨結(jié)合狀況檢測

1.4.1顯微CT檢測用顯微CT檢測骨—種植體界面和種植體周圍骨小梁的微結(jié)構(gòu)。實驗設(shè)定顯微CT掃描參數(shù)為:工作電壓90 kV，工作電流43 μA，720個投影數(shù)，整合時間0.5 s，分辨率0.008 μm。獲取全部圖像后，選定股骨膝關(guān)節(jié)骺板最低點下1 mm、種植體周圍600 μm的范圍區(qū)域作為感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）。分析數(shù)據(jù)包括ROI內(nèi)骨組織的相對骨體積分數(shù)（bone volume/tissue volume，BV/ TV），平均骨小梁粗度（trabecular thickness，Tb. Th），骨小梁間隙（trabecular separation，Tb.Sp），平均骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）和骨結(jié)合率（percentage of osseointegration，OI）。

顯微CT掃描完成后，隨機將同一大鼠獲得的兩個標本分別配入兩個組別內(nèi)，一組用于組織學(xué)切片觀察，另一組進行生物力學(xué)實驗。

1.4.2組織學(xué)觀察將標本用梯度乙醇脫水，樹脂包埋，用硬組織切片機制作不脫鈣硬組織切片，1%甲苯胺藍染色，在顯微鏡下觀察種植體周圍骨組織以及種植體與骨組織界面的情況。

1.4.3生物力學(xué)實驗使用萬能材料試驗電子測量儀的拉伸模具測定種植體在拉伸力作用下脫出的最大推出力，以此代表種植體在骨內(nèi)所獲得的最大固位力。實驗設(shè)定拉伸速度為5 mm·min-1。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對所測得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，對照組和實驗組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1脛骨顯微CT及組織學(xué)圖片

由脛骨的顯微CT及HE染色圖片（圖1）可以看出，對照組部分區(qū)域骨吸收形成了骨陷窩，部分區(qū)域骨小梁連接中斷，而實驗組骨小梁增多變密集并交織成網(wǎng)狀。

2.2種植體周圍骨組織的顯微CT掃描分析

種植術(shù)后12周種植體周圍骨界面的顯微CT圖像（圖2）顯示:實驗組骨小梁豐富，形態(tài)規(guī)則，相互之間連接成密集網(wǎng)狀，環(huán)繞種植體外緣還能明顯觀察到緊貼其生長的致密骨質(zhì)層（圖2右），說明種植體與骨組織結(jié)合緊密；對照組種植體周圍骨小梁較實驗組稀疏、纖細，甚至出現(xiàn)連接中斷，同時種植體周圍環(huán)繞種植體外緣生長的致密骨質(zhì)層有明顯減少（圖2左），說明種植體骨整合受骨質(zhì)疏松影響，出現(xiàn)了明顯的骨質(zhì)吸收。

圖1　脛骨顯微CT及組織學(xué)圖片F(xiàn)ig　1　Transverse micro-CT slices and coronal histological sections of the proximal tibiae

圖2　種植術(shù)后12周種植體周圍骨組織顯微CTFig　2　The micro-CT images of bone tissues surrounding implants 12 weeks after implant insertion

種植術(shù)后12周種植體周圍骨界面的顯微CT的分析結(jié)果見表1:實驗組BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N、OI均高于對照組（P＜0.05）。

2.3種植體周圍骨組織的組織學(xué)觀察

種植術(shù)后12周種植體周骨形態(tài)見圖3:相較于對照組，實驗組骨小梁及骨組織明顯增加，圍繞種植體骨周圍可觀察到連續(xù)的大量的新骨組織形成。

2.4生物力學(xué)實驗

對照組生物力學(xué)實驗結(jié)果為（21.65±4.36）N，實驗組為（70.32±10.91）N， 實驗組種植體的固位力有明顯提高（P＜0.05），與對照組比較，實驗組的最大推出力平均增加2.25倍。

表1　種植術(shù)后12周種植體周圍骨界面顯微CT掃描分析Tab　1　Quantitative results from micro-CT analysis of the peri-implant bone tissue within volume of interest 12 weeks after implant insertion

圖3　種植術(shù)后12周種植體周圍骨形態(tài)學(xué)觀察　甲苯胺藍染色× 100Fig　3　Histological images along the transverse plane of femurs with implants 12 weeks after implant insertion　toluidine blue stain　× 100

3　討論

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)損壞，骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。骨質(zhì)疏松癥可發(fā)生在不同性別、不同年齡的人群，但以老年男性和絕經(jīng)后婦女多見。骨質(zhì)的完整性取決于成骨細胞和破骨細胞之間的平衡，骨質(zhì)疏松發(fā)生時骨量減少，骨形成和骨吸收之間存在不平衡。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中最常見的類型，是一種雌激素缺乏和過度的骨吸收大于骨形成的骨代謝異常［8］，主要原因是卵巢功能衰退引起雌激素分泌不足。雌激素可以通過直接調(diào)節(jié)機制，旁分泌機制和細胞凋亡機制對成骨細胞和破骨細胞均發(fā)揮作用，進而影響骨的代謝［9］。絕經(jīng)后婦女骨丟失增加，同時伴有血漿催產(chǎn)素水平的降低，提示催產(chǎn)素與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有關(guān)。

骨質(zhì)疏松時在骨松質(zhì)區(qū)域，骨與種植體結(jié)合率和相對骨量有明顯降低。在種植體表面，提高骨新陳代謝，抑制過分骨吸收是非常必要的［10］。本實驗通過卵巢切除來建立大鼠骨質(zhì)疏松模型。卵巢切除手術(shù)后會降低種植體固位力。在去勢大鼠體內(nèi)，可顯著提高種植體固位力的藥物分兩類:一類為骨轉(zhuǎn)換抑制劑如雌激素、二膦酸鹽等［10］，主要是抑制破骨細胞活性從而抑制骨吸收；另一類為促進成骨細胞活性，刺激骨形成的制劑，如人重組甲狀旁腺素；但都有應(yīng)用局限性，存在可能引起骨壞死、增加血栓形成概率和罹患乳腺癌的風(fēng)險。

催產(chǎn)素的主要生理功能是促進分娩期子宮收縮與哺乳期排乳，在人體的分泌持續(xù)終生，并受卵巢激素水平和增齡因素的影響。研究［2］發(fā)現(xiàn)，催產(chǎn)素對骨代謝存在直接調(diào)節(jié)功能，成骨細胞和破骨細胞表面均存在催產(chǎn)素受體。Elabd等［4］研究證實，催產(chǎn)素是間充質(zhì)干細胞成骨分化的主要調(diào)節(jié)因子之一。另有文獻［11］報道，絕經(jīng)后婦女骨量丟失增加，同時伴有血漿催產(chǎn)素水平的降低，證實催產(chǎn)素與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)。本研究也觀察到催產(chǎn)素對骨代謝有調(diào)節(jié)作用，那么從臨床觀點出發(fā)，全身應(yīng)用催產(chǎn)素來增加種植體的固位力也許是可以嘗試的方法。

本實驗結(jié)果顯示，去勢大鼠在12周后，脛骨部分區(qū)域骨吸收形成了骨陷窩，部分區(qū)域骨小梁連接中斷，證明切除雙側(cè)卵巢后形成了脛骨的骨質(zhì)疏松。全身應(yīng)用催產(chǎn)素的實驗組可以看到粗大的骨小梁連接成密集的網(wǎng)狀，提示催產(chǎn)素對于骨質(zhì)疏松大鼠具有一定意義上的治療作用。

種植術(shù)后及全身應(yīng)用催產(chǎn)素后，顯微CT顯示，骨小梁明顯豐富，形態(tài)規(guī)則，相互之間連接成密集網(wǎng)狀，環(huán)繞種植體外緣還能明顯觀察到緊貼其生長的致密骨質(zhì)層，說明種植體與骨組織結(jié)合緊密，各項骨小梁顯微參數(shù)均明顯提高，BV/TV平均增加2.2倍，OI平均增加0.55倍；組織學(xué)圖片顯示新生骨量增加明顯，表明應(yīng)用催產(chǎn)素能夠增加骨量；實驗組種植體的最大推出力平均增加2.25倍，進一步證明催產(chǎn)素對種植體固位力的正面效應(yīng)。

催產(chǎn)素對脛骨近端和種植體周骨組織的積極影響，可能在于其對骨形成或骨吸收的影響，也可能對兩者同時存在影響。因為在成骨細胞和破骨細胞中均發(fā)現(xiàn)有催產(chǎn)素受體，所以催產(chǎn)素有可能同時影響骨形成和骨吸收過程。Tamma等［12］報道，催產(chǎn)素或催產(chǎn)素受體的缺失會導(dǎo)致小鼠骨形成減少，因為催產(chǎn)素可以刺激不同種類的成骨細胞表型礦化。本研究結(jié)果表明，去勢大鼠全身應(yīng)用催產(chǎn)素對純鈦種植體骨結(jié)合有正向影響，能夠增加種植體周圍骨量，由此推測，應(yīng)用催產(chǎn)素來增加種植體的固位力在臨床實踐中或許是可行的；但催產(chǎn)素對種植體周骨組織影響的機制尚需進一步研究。

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（本文編輯吳愛華）

Efficacy of systemic administration of oxytocin on implant osseointegration in osteoporotic rats

Wang Maiquan1， Peng Liwei1， Li Yunfeng2.（1. Dept. of Stomatology， The People's Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450003， China；2. State Key Laboratory of Oral Diseases， Dept. of Orthognathic and Temporomandibular Joint Surgery， West China Hospital of Stomatology， Sichuan University， Chengdu 610041， China）
Supported by: The National Nature Science Foundation of China （81300858）. Correspondence: Li Yunfeng， E-mail: doctorlyf @163.com.

ObjectiveThis study investigated the effects of systemic administration of oxytocin （OT） in osteoporotic rats on implant osseointegration. MethodsTwenty rats were randomly assigned to the control and experimental groups. Initially，the rats underwent bilateral ovariectomy. After 12 weeks， an osteoporosis model was established. Each rat received an implant at the distal and middle femoral metaphysis. Simultaneously， systemic administration was conducted with one group receiving subcutaneous injection of OT （1 mg·kg-1per day）， whereas the other group received placebo injection. After treatment for 4 weeks， another surgery was conducted to remove the thigh bones from the rats containing the implants for an eight-week observation. With the employment of micro-CT， histological observation and push-out test， osseointegration was evaluated. While the rats received thigh-bone removal surgery， another surgery was conducted to remove the tibia metaphysis from the rats of both groups to perform histological observation and micro-CT inspection. ResultsThe trabecular bone of tibial samples was intensive and formed woven mesh structure in the experimental group compared with the control group. In the experimental group， the relative bone volume/tissue volume surrounding the implant， the bone contact ratio， and the maximum push-out force of the implant were 0.35%±0.06%， 67.25%±9.06%， and （70.32±10.91） N， respectively， the corresponding values were 0.11%±0.02%， 43.25%±7.01% and （21.65±4.36） N in the control group， and the experimental group increased significantly compared with the control group （P＜0.05）. ConclusionSystemic administration of OT cannot only antagonize the negative effects of osteoporosis but can also promote implant healing and osseointegration of pure titanium implants.

oxytocin；dental implants；osteoporosis；osseointegration

R 783

A

10.7518/hxkq.2016.04.002

2015-10-12；

2016-03-27

國家自然科學(xué)基金（81300858）

王買全，主治醫(yī)師，碩士，E-mail:wmq0115@126.com

李運峰，副教授，博士，E-mail:doctorlyf@163.com