掌跖角化-牙周破壞綜合征個案患者家系組織蛋白酶C的基因突變分析

陳遠嬌　李晨軍

成都軍區總醫院口腔科，成都 610017

掌跖角化-牙周破壞綜合征個案患者家系組織蛋白酶C的基因突變分析

陳遠嬌李晨軍

成都軍區總醫院口腔科，成都 610017

目的通過研究一例掌跖角化-牙周破壞綜合征（PLS）患者及其家系組織蛋白酶C（CTSC）基因突變的特點，提供PLS分子致病機制的理論依據，豐富PLS基因診斷和治療的科學資料。方法取得臨床發現的一例PLS先證者及其家屬知情同意，分別提取先證者及其父母、姐姐的基因組DNA，應用聚合酶鏈反應和DNA直接測序技術，分析先證者及其直系血親CTSC基因的突變情況。結果PLS先證者CTSC基因存在復合型雜合突變，突變位點是c.754C＞T和c.1040A＞G，其父母均為攜帶者，姐姐未發現突變。結論PLS先證者的臨床表征是由CTSC基因突變引起。

組織蛋白酶C；掌跖角化-牙周破壞綜合征；基因突變

掌跖角化-牙周破壞綜合征（Papillon-Lefèvre syndrome，PLS）是1924年由法國人Papillon和Lefèvre首次報告的常染色體隱性遺傳性疾病，其發病率約為百萬分之一至四［1］。男女發病率相似，未見種族特異性，多發于有近親結婚史的家系。PLS以早發的快速進展的重度牙周組織破壞和掌跖過度角化為特征，牙周組織嚴重破壞且發現較晚時常導致乳恒牙的早期脫落。迄今為止，PLS的病因和致病機制還不完全清楚，但已有的研究結果表明位于染色體11q14.2的組織蛋白酶C（cathepsin C，CTSC）基因的突變是PLS的致病基礎［2］。本研究對臨床確診的一個PLS患者家系進行CTSC基因分析。

1　材料和方法

1.1研究對象

先證者為一名臨床確診為PLS的患兒，該患兒于2010年9月（8歲）因新萌牙齒松動、伴牙齒咬合疼痛、牙齦出血就診。就診時口腔檢查:所有乳牙脫落，3、8、9、10、14、19、23、24、25、26、30萌出，多數牙松動并探及深牙周袋、牙周溢膿；未萌恒牙區的下頜牙槽嵴低平狹窄，牙齦未見明顯炎癥表現（圖1）。X線片示全口牙槽骨廣泛性吸收，4顆第一磨牙僅根尖處見少量牙槽骨（圖2）。雙手掌、足底皮膚過度角化，脫屑，病損厚度不一，呈魚鱗狀。足底皮膚損害累及足背和跟腱，雙側膝關節區見輕度皮膚損害。手背、指甲及肘關節無明顯異常。全身皮膚無膿腫，無多汗及臭汗。現先證者13歲，發育良好，智力正常，恒牙均萌出，牙列擁擠，僅19、24、25輕微松動，牙齦呈輕度炎癥。家系追溯4代，現存17人，無近親結婚史，了解相關病史，對各家系成員進行全身及牙周專科檢查，僅發現先證者一名受累。先證者共有直系血親3人，包括父親、母親及一名姐姐，3人的牙周及全身檢查結果顯示均無侵襲性牙周炎及掌跖角化癥狀。

圖1　初診時先證者口內照Fig　1　Intraoral view of propositus at the baseline

圖2　初診時先證者口腔曲面斷層片Fig　2　Panoramic radiograph of propositus at the baseline

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取因該PLS家系僅患兒一名先證者，故選擇先證者及其直系血親作為實驗對象。取得受試者知情同意后，抽取外周靜脈血各5 mL，枸櫞酸鈉抗凝，使用血液DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取基因組DNA。

1.2.2引物設計和合成參照Toomes等［3］和Hart等［4］關于CTSC基因1～7外顯子引物設計方案設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）PCR反應體系為50 μL體系，包括10×PCR buffer 5 μL、25 mmol·L-1dNTP 4 μL、10 μmol·L-1上游引物1 μL、10 μmol·L-1下游引物1 μL、5 U·μL-1Taq酶0.5 μL、ddH2O 33.5 μL，模板DNA 5 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性3 min，94 ℃變形30 s，按各外顯子的退火溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環后于72 ℃再延伸10 min。反應在GeneAmp PCR System 9600（PerkinElmer公司，美國）上進行。

1.2.4DNA直接測序使用瓊脂糖凝膠分別純化所得CTSC基因外顯子1～7的PCR產物，并將純化后的PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序，其中外顯子5使用正向巢氏測序引物，其余外顯子使用PCR擴增引物，測序結果與人類基因組中的CTSC基因序列進行對比分析。

2　結果

2.1CTSC基因外顯子5突變情況

先證者位于外顯子5的第754位堿基發生了一個雜合突變，該堿基對中的堿基C被T取代（c.754C＞T）（圖3a），與之相對應的第252位氨基酸密碼子由CAA改變為TAA，其編碼的氨基酸由谷氨酰胺改變為終止密碼子（p.Q252X），該無義突變使該條染色體上的CTSC基因編碼的氨基酸縮短為251個氨基酸。該突變位點以前的研究均未報道過，屬于新突變位點。先證者的父親于外顯子5的第754位堿基也發現了一個與先證者相同的雜合突變（圖3b），先證者的母親及姐姐均未在外顯子5上發現突變位點（圖3c、d）。

圖3　CTSC基因外顯子5測序Fig　3　Sequencing of CTSC gene mutation of exon 5

2.2CTSC基因外顯子7突變情況

先證者位于外顯子7的第1 040位堿基發生了一個雜合突變（圖4a），該堿基對中的堿基A被G取代（c.1040A＞G），與之相對應的第347位氨基酸密碼子由TAT改變為TGT，其編碼的氨基酸由酪氨酸改變為半胱氨酸（p.Y347C）。先證者的母親于外顯子7的第1 040位堿基也發現了一個與先證者相同的雜合突變（圖4b），先證者的父親及姐姐均未在外顯子7上發現突變位點（圖4c、d）。

圖4　CTSC基因外顯子7測序Fig　4　Sequencing of CTSC gene mutation of exon 7

2.3CTSC基因內含子1的改變

先證者外顯子2的PCR產物正向測序發現:CTSC基因內含子1距外顯子2序列始端有一個13個堿基T的連續序列，先證者這個連續序列含有一個堿基T的雜合缺失，造成外顯子2的序列無法檢測（圖5a）。接著對先證者及其雙親、姐姐的外顯子2的PCR產物行反向測序，結果均未在外顯子2上發現突變，在內含子1末尾的T堿基連續序列均發現一個堿基T雜合缺失，但該缺失不位于內含子1和外顯子2的接合處，不影響CTSC基因的轉錄和翻譯（圖5b～e）。

圖5　CTSC基因內含子1測序Fig　5　Sequencing of CTSC gene mutation of intron 1

由此可見，PLS先證者CTSC基因存在復合型雜合突變，突變位點是外顯子5上的c.754C＞T 和外顯子7上的c.1040A＞G，其父母均為攜帶者，姐姐未發現突變。另外，先證者及其父母、姐姐均在CTSC基因內含子1末尾的T堿基連續序列中發現一個堿基T的雜合缺失。

3　討論

PLS屬于常染色體隱性遺傳疾病，位于常染色體11q14.2的CTSC基因突變是PLS的致病基礎［2］。迄今為此，已經發現70多種CTSC基因突變型與PLS有關，其中無義突變和錯義突變較多［5］。本實驗發現的c.754C＞T以前從未報道過，是CTSC基因的新突變位點，c.1040A＞G早在Toomes等［3］證實CTSC基因突變是PLS的遺傳學基礎的研究中已經被發現，并被認為可能是PLS患者CTSC的突變熱點［2］。

CTSC基因突變類型中，以純合突變或純合子突變合并雜合突變為主，本實驗中先證者由兩個雜合突變組合的復合型雜合突變較少。目前研究［6］不能確定CTSC基因是否有特異性突變。另外，先證者及其父母、姐姐均在CTSC基因內含子1末尾的T堿基連續序列中發現一個堿基T的雜合缺失，該缺失距離內含子1和外顯子2的接合處較遠，不會影響CTSC基因內含子的剪接、成熟mRNA的加工及后期mRNA的轉錄，考慮為CTSC基因多態性位點［7］。

c.754C和c.1040A都位于CTSC基因的高度保守序列［7］，c.754C＞T致使編碼谷氨酰胺的第252位密碼子CAA被終止密碼子TAA替代，致使后來合成的CTSC肽鏈縮短；c.1040A＞G導致第347位氨基酸密碼子TAT被TGT替換，轉錄過程中半胱氨酸替換正常序列中的酪氨酸（p.Y347C）。半胱氨酸替換酪氨酸，不但改變肽鏈的結構，還影響肽鏈的折疊和組裝，妨礙CTSC功能蛋白質的形成。c.754C＞T和c.1040A＞G的復合型雜合突變，可能嚴重影響CTSC基因合成有功能的蛋白質，致使CTSC的活性顯著降低甚至缺乏。

CTSC在中性粒細胞、具有細胞毒性的淋巴細胞、自然殺傷細胞、牙槽骨內巨噬細胞以及肥大細胞等免疫細胞中表達較高，可以活化中性粒細胞衍生的絲氨酸蛋白酶和粒酶，影響免疫反應［8-9］。由于CTSC基因突變引起的免疫紊亂增加了PLS患者的炎癥易感性，致使PLS患者更容易發生嚴重的少發的炎癥性疾病［6］。所以，可推測本實驗中的先證者因CTSC基因的復合型雜合突變致使牙周組織中CTSC活性幾乎完全喪失，引起牙周組織的免疫反應紊亂和嚴重的牙周炎癥。先證者乳牙期雖未追溯到明顯的牙齦炎癥表現，但存在乳牙早脫、萌出恒牙牙周炎重等早發性重度牙周炎表現，與上述推測符合。

大部分PLS患者都有過度的掌跖角化癥狀和早發的快速進展性牙周炎這兩個典型的臨床表現，但是少數病例中患者表現為不典型的臨床癥狀或一些少發的臨床表現，因此，有學者［5，10］就CTSC基因的突變位點及類型與PLS患者的臨床表型之間的關系進行了研究，結果顯示:PLS患者致病基因的遺傳異質性低、等位基因異質性高，即PLS的致病基因僅是CTSC基因，CTSC基因發生不同類型的突變產生多種異常表型的概率高；PLS患者顯著的表型異質性與特別的基因突變類型間無確切聯系，但可能與一些附加基因的修飾和后天環境因素的影響有關。CTSC基因突變是PLS遺傳學基礎已經被證實，其可作為PLS診斷的新措施，特別適用于一些臨床癥狀不典型但疑為PLS病例的診斷。

目前，PLS的治療措施有限，掌跖角化病損和牙周破壞都以對癥治療為主。早期給予牙周干預治療，可以盡量保存PLS患者牙周情況較好的乳恒牙甚至全口健康的恒牙。CTSC基因檢測可作為一種篩查手段，增大早期發現PLS的機率。近期研究［11］顯示，PLS患者的牙周炎癥反應的改變與血清IgE含量變化一致，IgE有可能作為監測PLS牙周炎癥反應程度的指示因子。全面了解PLS的病因和致病機制，以及病因與臨床表型的關系，從病因出發，采用基因治療的方法糾正或補償CTSC基因的異常和缺陷，有望打破PLS治療方面的困境。

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（本文編輯李彩）

Gene mutational analyses of the cathepsin C gene in families with Papillon-Lefèvre syndrome

Chen Yuanjiao， Li Chenjun.（Dept. of Stomatology， Chengdu Military General Hospital， Chengdu 610017， China）
Correspondence: Li Chenjun， E-mail: lichenjun65@163.com.

ObjectiveThis study aims to investigate the gene mutational characteristics of cathepsin C （CTSC） gene in a Chinese patient with Papillon-Lefèvre syndrome （PLS）， then further confirm the genetic basis for the phenotype of PLS， and obtain genetic information that can be used as guide in the diagnosis and treatment of PLS. MethodsWith their consent，peripheral blood samples were obtained from the proband and his family members （his parents and older sister） for genomic DNA extraction. The coding region and exon/intron boundaries of the CTSC gene were amplified and sequenced using polymerase chain reaction and direct sequencing of DNA. ResultsCompound heterozygous mutations of CTSC gene were identified in the patient. The proband carries one heterozygous nonsense mutation c.754C＞T in exon 5 and one heterozygous missense mutation c.1040A＞G in exon 7. Both parents were heterozygous carriers without the clinical symptoms of PLS. None of the mutations were detected in the proband's sister. ConclusionThe study proves that mutations of CTSC gene are responsible for the phenotype of Papillon-Lefèvre syndrome.

cathepsin C；Papillon-Lefèvre syndrome；gene mutation

R 781.6

A

10.7518/hxkq.2016.04.005

2015-12-16；

2016-02-18

陳遠嬌，住院醫師，碩士，E-mail:chenyuanjiao2010@ 163.com

李晨軍，副主任醫師，碩士，E-mail:lichenjun65@163. com