QuEChERS方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測雞肉組織中扎那米韋藥物的殘留量

任明興,劉正才，唐寰宇，楊　方，林永輝，蘇芝嬌，董文洪

(1.紹興出入境檢驗檢疫局，浙江　紹興　312000;2.福建出入境檢驗檢疫局，福建　福州　350001)

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QuEChERS方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測雞肉組織中扎那米韋藥物的殘留量

任明興1,劉正才2*，唐寰宇2，楊方2，林永輝2，蘇芝嬌2，董文洪1

(1.紹興出入境檢驗檢疫局，浙江紹興312000;2.福建出入境檢驗檢疫局，福建福州350001)

應用QuEChERS前處理技術(shù)，建立了雞肉和雞肝中扎那米韋殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定方法。樣品經(jīng)0.2 mol/L鹽酸溶液-甲醇(1∶9)超聲提取，離心后分取上清液，應用QuEChERS凈化。化合物采用NUCLEOSHELL?HILIC (3.0 mm×100 mm，2.7 μm)柱以5 mmol/L乙酸銨-0.2%甲酸溶液和乙腈為流動相梯度洗脫分離，電噴霧電離(ESI)正離子多反應監(jiān)測模式(MRM)進行測定，標準曲線外標法定量。結(jié)果表明，扎那米韋在5～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.990;方法的定量下限(S/N=10)為10 μg/kg。以雞肉和雞肝為基質(zhì)，在10，20，100 μg/kg加標水平下的平均回收率為80.5%～88.7%，相對標準偏差(RSD，n=6)為7.3%～11.8%，已應用于實際雞肉樣品的檢測。該方法靈敏度高、重復性好、操作簡單、快捷，適用于雞肉組織中扎那米韋殘留量的分析測定。

QuEChERS方法;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;扎那米韋;殘留量;雞肉組織

扎那米韋(Zanamivir)是1999年由美國食品與藥品管理局批準用于治療A型和B型流感的藥物，其作用機制可能在于抑制流感病毒的神經(jīng)氨酸酶，從而改變流感病毒在感染宿主細胞內(nèi)的聚集與釋放[1];同時，扎那米韋也是一種有效的抗禽流感藥物，但長期使用會在動物體內(nèi)形成藥物殘留導致中毒，并誘發(fā)病毒產(chǎn)生變異等癥狀，甚至會造成死亡危害人類健康[2-3]，美國FDA規(guī)定禁止扎那米韋用于畜禽類疾病的防治[4]，我國農(nóng)業(yè)部公告第560號公告也規(guī)定禁止其作為獸用藥物。

目前，檢測可食性動物組織內(nèi)扎那米韋殘留的方法有液相色譜法(HPLC)[5-7]、液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[8-10]、液相色譜-高分辨率質(zhì)譜法(LC-HRTOF)[11]等。扎那米韋屬于強極性化合物，在HPLC分離的常規(guī)色譜柱上無法保留，需借助離子對試劑或衍生劑來檢測，且檢出限無法滿足要求;LC-HRTOF在高分辨率掃描模式下可鎖定目標化合物的精確質(zhì)量數(shù)，具有較高的準確度，但高分辨率質(zhì)譜的運行和維護成本較高，操作難度大;HPLC-MS/MS技術(shù)在檢測的靈敏度、準確性和重復性方面具有較明顯的優(yōu)勢，具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)勢，適用于可食性動物組織中扎那米韋殘留的分析測定。上述報道的樣品凈化技術(shù)均為液-液萃取和固相萃取方法。QuEChERS方法是近年國際上最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術(shù)[12]，其原理是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而實現(xiàn)除雜凈化，方法操作簡單，可高效、快速地提取凈化樣品，被廣泛應用于農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、毒素等檢測[13-15]。目前運用QuEChERS方法對扎那米韋的殘留檢測尚未見報道，本文采用該技術(shù)對雞肉樣品進行前處理，以酸性甲醇提取樣品中殘留的扎那米韋，用C18粉和PSA同時吸附蛋白質(zhì)、脂肪和酸性雜質(zhì)實現(xiàn)樣品的凈化，所得上清液濃縮后經(jīng)HILIC親水色譜柱進行分離分析，為強極性化合物扎那米韋的快速檢測提供了一種新方法。

1　實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

ACQUITY UPLC超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(API5500，美國AB Sciex公司);高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司);渦旋混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠);Milli-Q純水系統(tǒng)(Millipore公司)。

乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，德國CNW公司);乙酸、三氯乙酸、鹽酸、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司);扎那米韋標準品(純度>98.0%，Sigma公司);N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑(PSA)和C18吸附劑(40 μm，美國Agilent公司)。實驗用雞肉樣品購于超市。

準確稱取適量扎那米韋標準品,用水溶解后以甲醇-水(1∶1)定容，配制成100 μg/mL的標準儲備液，置于-4 ℃冰箱中保存;取適量標準儲備液并用甲醇-水(1∶1)稀釋成1 μg/mL標準中間液。根據(jù)需要用水逐級稀釋成適當濃度的標準工作液。

1.2樣品前處理

稱取5.0 g樣品于50.0 mL塑料離心管中，加入10 mL甲醇-0.2 mol/L鹽酸溶液(9∶1)，振蕩混勻2.0 min，超聲10 min后以8 000 r/min離心5 min。取上層溶液5.0 mL至預先裝有250 mg無水硫酸鈉、150 mg PSA、200 mg C18粉吸附劑的離心管中，旋渦混合2 min，3 000 r/min離心2 min，移取2.5 mL上清液于另一5.0 mL空的離心管中，45 ℃下氮氣吹干。加入1.0 mL 乙腈-0.1%甲酸溶液(1∶9)溶解殘渣，過0.22 μm微孔濾膜后供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱：NUCLEOSHELL?HILIC (3.0 mm × 100 mm，2.7 μm)。流動相：A為5 mmol/L乙酸銨溶液-0.2 %甲酸;B為乙腈;梯度洗脫程序：0～1.5 min，10%A;1.5～3.0 min，10%～20%A;3.0～5.0 min，20%～40%A;5.0～6.0 min ，40%～10%A;6.0～10.0 min，10%A。流速0.4 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件電離模式：電噴霧電離正離子模式(ESI+);檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM);扎那米韋母離子m/z333.1;定量離子m/z60.1，碰撞能量35 eV;定性離子m/z121.1，碰撞能量47 eV。電噴霧電壓(IS)：5 500 V;氣簾氣壓力(CUR)：0.172 MPa(氮氣);離子源溫度(TEM)：500 ℃;霧化氣壓力0.379 MPa;輔助氣壓力0.379 MPa。

1.3.3超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定將扎那米韋基質(zhì)標準工作溶液在設定條件下分別進樣，以定量離子峰面積(y)為縱坐標，扎那米韋濃度(x，ng/mL)為橫坐標，繪制標準工作曲線。用該標準工作曲線對樣品進行定量，樣品溶液中扎那米韋的響應值應均在儀器測定的線性范圍內(nèi)。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜分離條件的優(yōu)化

分別選用C18,C8和HILIC 3種類型色譜柱進行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C18柱對扎那米韋基本無保留;C8柱對扎那米韋的保留較弱，但基體抑制效應較強;鍵合醇羥基的HILIC柱也無保留，鍵合酰胺基的HILIC柱雖有較好的保留，但質(zhì)譜儀器響應值較低;而采用季銨鹽和磺酸混合鍵合硅膠的兩性離子基團的HILIC柱可獲得較好的分離效果，因此選其作為分離柱。選擇乙腈為有機相，分別以5 mmol/L乙酸銨溶液、水、0.2%甲酸溶液、5 mmol/L乙酸銨-0.2%甲酸溶液等作為流動相的水相進行色譜分離實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水相選用5 mmol/L乙酸銨溶液或水時，色譜峰形展寬，選用0.2%甲酸溶液時，對扎那米韋保留較弱，而選用5 mmol/L乙酸銨-0.2%甲酸溶液和乙腈作為流動相時，可獲得較好分離效果。進一步考察了不同濃度甲酸(0.1%，0.2%，0.3%)、乙酸銨(2，5，10 mmol/L)以及不同流速對化合物分離效果的影響。結(jié)果顯示以5 mmol/L乙酸銨-0.2%甲酸溶液和乙腈為流動相，流速0.4 mL/min時獲得的峰形最好。

圖1　扎那米韋標準品的二級離子碎片掃描 質(zhì)譜圖以及可能的裂解方式Fig.1　The product scan spectrogram and main fragmentation pattern of zanamivir

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別在正負離子模式下全掃描扎那米韋標準溶液(1.0 mg/L)，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下響應值更高。進行一級質(zhì)譜圖全掃描，得到[M+H]+(m/z333.5)準分子離子峰，對選定的母離子進行子離子掃描，二級離子碎片掃描質(zhì)譜圖及可能的斷裂規(guī)律見圖1。選取離子m/z60.1作為扎那米韋的定量離子，m/z121.1作為定性離子，分別對子離子的碰撞能量進行優(yōu)化，并在MRM模式下對霧化氣壓力、干燥氣溫度和流量等參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化參數(shù)見“1.3.2”。

2.3提取劑的選擇

傳統(tǒng)的QuEChERS方法通常選用乙腈或酸化乙腈作為提取劑，既有利于液液分層還能起到沉淀蛋白的作用，而扎那米韋易溶于水，微溶于甲醇，不溶于乙醚等有機溶劑。分別考察了乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯作為提取劑時對雞肉中扎那米韋的提取效果。結(jié)果顯示，甲醇的提取效率明顯高于其它試劑。考慮到雞肉基體雜質(zhì)多，含蛋白、油脂較高，而扎那米韋易溶于水而難溶于有機溶劑等因素，實驗比較了不同比例的鹽酸-甲醇、乙酸-甲醇、甲酸-甲醇、三氯乙酸(TCA)-甲醇等混合溶液對扎那米韋的提取回收率以及沉淀蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2 mol/L鹽酸溶液-甲醇(1∶9)混合溶劑的提取效果最好，此時扎那米韋的提取回收率為75%～87%。進一步考察了振蕩提取、均質(zhì)提取、超聲提取3種不同提取方式對提取效率的影響，結(jié)果表明3種提取方式對扎那米韋的提取效率相近，因此實驗選擇易操作的超聲提取法。

2.4QuEChERS凈化條件的選擇

扎那米韋結(jié)構(gòu)上帶有3個羥基，屬于強極性化合物，同時也帶有氨基(pKa=3.8)，屬于弱堿性，在酸性溶液中主要以分子與離子狀態(tài)共存，常規(guī)的C18型和離子交換型的固相萃取小柱均難以保留，QuEChERS方法使用分散固相萃取(DSPE)凈化，固相吸附劑直接加入樣品提取液以吸附干擾物，因此，重點研究了改良QuEChERS法對扎那米韋的凈化。常用的固相吸附劑有C18粉、PSA等，PSA可吸附糖、有機酸等極性干擾物;C18可吸附脂肪等非極性干擾物，但吸附劑對目標化合物的吸附會導致回收率降低，影響測定結(jié)果的準確性，因此，對吸附劑的種類以及用量進行了優(yōu)化。將扎那米韋直接加入空白雞肉基質(zhì)提取液中，按照本方法分別加入PSA和C18進行凈化，考察不同吸附劑組合對基質(zhì)的凈化效果。結(jié)果表明，在實驗條件下吸附劑PSA和C18對扎那米韋基本無吸附，2種凈化劑組合均對基質(zhì)有較好的凈化作用，因此選擇混合吸附劑PSA+C18。進一步研究了PSA吸附劑用量對空白樣品基質(zhì)提取液凈化效果的影響，發(fā)現(xiàn)當PSA用量達30 mg/mL時可顯著減少干擾峰的影響，繼續(xù)增加其用量時凈化效果無明顯改善。進一步考察C18吸附劑用量對扎那米韋的吸附作用，結(jié)果表明，隨著C18用量由20 mg/mL增至40 mg/mL，扎那米韋的回收率逐漸上升，但用量達到50 mg/mL時回收率開始下降。因此分別選擇吸附劑PSA和C18的用量為30 mg/mL和40 mg/mL。另外，實驗還比較了脫水劑無水MgSO4與無水Na2SO4對萃取回收率的影響，發(fā)現(xiàn)加入無水MgSO4會導致扎那米韋的回收率明顯降低(見圖2)，因此選用無水Na2SO4作為扎那米韋的脫水劑;進一步考察了無水Na2SO4的用量，發(fā)現(xiàn)隨著無水Na2SO4的增加，回收率逐漸上升，用量達到50 mg/mL時基本達到飽和。

圖2　不同吸附劑的種類和用量對扎那米韋 提取效率的影響(n=3)Fig.2　Influence of different sorbent composition on extraction efficiency of zanamivir(n=3)

圖3　雞肉空白基質(zhì)(a)與雞肉加標10 μg/kg(b) 的MRM色譜圖Fig.3　MRM chromatograms of blank chicken(a) and chicken spiked with 10 μg/kg zanamivir(b)

2.5基質(zhì)效應的考察

液相色譜-質(zhì)譜方法開發(fā)和確證過程中需對基質(zhì)效應作出評價,基質(zhì)效應會對分析方法的重復性、靈敏度、準確度等產(chǎn)生較大影響，尤其是使用ESI源，常表現(xiàn)為對目標化合物的離子抑制作用[16]。本文以基質(zhì)匹配校準曲線的斜率/溶劑標準校準曲線的斜率[17]考察化合物的基質(zhì)效應，其比值越接近 1，則基質(zhì)效應越小，反之亦然。分別比較了空白基質(zhì)提取液、雞肉提取液在不同添加水平(5.0，10，20，100 μg/L)下的基質(zhì)效應，結(jié)果表明，不加凈化劑和加凈化劑后的基質(zhì)抑制效應分別為58%和25%。本文使用基質(zhì)匹配標準曲線的方法來進行化合物的定量測定。

2.6方法學評價

2.6.1線性范圍、檢出限與定量下限用QuEChERS方法凈化后的空白樣品溶液配制質(zhì)量濃度分別為0，5，10，20，50，100 ng/mL的扎那米韋系列標準溶液，按“1.2”方法進行測定。以分析物的峰面積(y)和質(zhì)量濃度(x，ng/mL)進行線性回歸分析。結(jié)果表明，扎那米韋的線性范圍為5～100 ng/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.990。以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)計算定量下限(LOQ)，雞肉和雞肝中扎那米韋的LOD分別為3.0 μg/kg和3.2 μg/kg，LOQ均為10 μg/kg(見表1)。

表1　扎那米韋的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量下限及平均回收率(n=6)

2.6.2回收率與精密度選取空白的雞肉和雞肝作為加標回收實驗基質(zhì)，分別進行10，20，100 μg/kg 3個不同水平的加標回收試驗，每個水平平行6組，結(jié)果如表1所示。在不同加標濃度下扎那米韋的平均回收率為80.5%～88.7%，相對標準偏差(RSD)為7.3%～11.8%。空白雞肉加標樣品的色譜圖見圖3，扎那米韋的峰形良好，無雜質(zhì)干擾。

2.7方法應用

運用本文建立的分析方法對購于市場的22份雞肉樣品進行檢測，采用基質(zhì)匹配外標法進行定量分析，結(jié)果均未檢出扎那米韋殘留。

3　結(jié)　論

本文基于QuEChERS技術(shù)，建立了雞肉組織中扎那米韋殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法快速、簡單、準確可靠，符合殘留檢測的要求，為雞肉中扎那米韋的快速檢測提供了簡便的樣品前處理方法和分析手段。

[1]Ye M.Chin.Pharm.J.(葉敏.中國藥學雜志)，2000，35(2):136-137.

[2]Li Z R.WorldNotesonAntibiotics(李卓榮.國外醫(yī)藥抗生素分冊)，2001，22(4):183-187.

[3]Cheng Z G，F(xiàn)u W L，Liu S Z.J.Tradit.Chin.Veter.Med.(程忠剛，傅偉龍，劉樹中.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志)， 2010，8(156):42-45.

[4]Davis J L，Smith G W，Baynes R E，Tell L A，Webb A I，Riviere J E.J.Am.Veter.Med.Assoc.,2009，235(5):528-534.

[5]Ji W，Chen D Y，Li P，Zhou X，Lu Q H.Chin.Pharm.J.Symp.(季旼，陳東英，李平，周驍，陸勤華.中國藥學學術(shù)年會論文集)，2006:161-167.

[6]Stubbs R J，Harker A J.J.Chromatogr.B，1995，670 (2):279-285.

[7]Morris D M，Hussey B K，Geurin S L，Selinger K A.J.Pharm.Biomed.Anal.，1995，14 (1/2):191-201.

[8]Lindegardh N，Hanpithakpong W，Kamanikom B，F(xiàn)arrar J，Hien T T，Singhasivanon P，White N J，Day N P J.Bioanalysis，2011，3(2):157-165.

[9]Bjorn J A B,Robin S W,Martien L E,Alida A M S,Stefan W.Anal.Bioanal.Chem.，2012，402(4):1611-1623.

[10]Todd M B，Wayne L W，Kathryn A H.J.Chromatogr.B，2007，852:505-511.

[11]Ge J，Liu F M，Holmes E H，Ostrander G K，Li Q X.J.Chromatogr.B,2012，906:58-62.

[12]Anastassiades M，Lehotay S J，Stajnbaher D，Schenck F J.J.AOACInt.，2003，86(2):412-431.

[13]Li R，Chu D K，Zhang P J，Gao Y Q，Huang S Y.J.Instrum.Anal.(李蓉，儲大可，張朋杰，高永清，黃思允．分析測試學報)，2015，34(5)：502-511.

[14]Xu X，Geng D D，Xiao Y C，Hu F Z.J.Instrum.Anal.(許旭，耿丹丹，肖遠燦，胡風祖．分析測試學報)，2015，34(7):807-812.

[15]Guo L Q，Gong X M，Ding K Y，Wang K，Sun J，Zhao H.J.Instrum.Anal.(郭禮強，宮小明，丁葵英，王可，孫軍，趙晗．分析測試學報)，2015，34(2)：141-146.

[16]Kwon H，Lehotay S J，Geis-Asteggiante L.J.Chromatogr.A，2012，1270:235-245.

[17]Matuszewski B K，Constanzer M L，Chavez-Eng C M.Anal.Chem.，2003，75:3019-3030.

Rapid Determination of Zanamivir Residues in Chicken Tissues Using QuEChERS Combined with Ultra-performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

REN Ming-xing1，LIU Zheng-cai2*，TANG Huan-yu2,YANG Fang2，LIN Yong-hui2，SU Zhi-jiao2,DONG Wen-hong1

(1.Shaoxing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau,Shaoxing312000，China;2.Fujian Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau，F(xiàn)uzhou350001，China )

A rapid method for the determination of zanamivir residues chicken tissues was developed using QuEChERS approach coupled with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).After ultrasonically extracted with(0.2 mol/L) hydrochloric acid-methanol(1∶9),the supernate was purified by QuEChERS method.The separation was performed on a NUCLEOSHELL?HILIC(3.0 mm×100 mm，2.7 μm) column by gradient elution using a mobile phase consisted of 5 mmol/L ammonium acetate(containing 0.2% formic acid) and acetonitrile.The identification of zanamivir was carried out by MS/MS in positive electrospray ionization(ESI+) and multiple-reaction monitoring(MRM) mode，and the quantification was performed by the external standard calibration method.The results showed that the calibration curves were linear in the range of 5-100 ng/mL with correlation coefficients(r) greater than 0.990.The limits of quantitation(LOQs，S/N=10) of this method were 10.0 μg/kg for the chicken muscle and liver.The average recoveries of zanamivir at three spiked levels of 10，20，100 μg/kg were in the range of 80.5%-88.7% with relative standard deviations(RSDs，n=6) of 7.3%-11.8%.The method was applied in the determination of zanamivir residues in practical chickens.The developed method is simple，accurate，rapid，sensitive and efficient,and could be applied in the determination of zanamivir residues in chicken tissues.

QuEChERS;ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS);zanamivir;residues;chicken tissues

2015-12-28；

2016-01-09

國家質(zhì)檢總局科技項目(2014IK110)

劉正才，高級工程師，研究方向：食品安全檢測，Tel：0591-87065542，E-mail:54369174@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.013

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)07-0854-05