DART-Orbitrap質譜法對黃芩藥材的快速分析

李樂樂 ，郭云龍 ，劉文龍 ，李　卓 ，王　洋 ，劉淑瑩,3*

(1.長春中醫藥大學　吉林省人參科學研究院，吉林　長春　130117；2.長春中醫藥大學　附屬醫院，吉林　長春　130021；3.中國科學院　長春應用化學研究所，吉林　長春　130022)

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DART-Orbitrap質譜法對黃芩藥材的快速分析

李樂樂1，郭云龍1，劉文龍1，李卓2，王洋1，劉淑瑩1,3*

(1.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春130117；2.長春中醫藥大學附屬醫院，吉林長春130021；3.中國科學院長春應用化學研究所，吉林長春130022)

將實時直接分析(DART)離子源與高分辨率質譜Orbitrap聯用，建立了一種對黃芩藥材進行快速定性定量分析的方法。定性分析時，對其中的化學成分進行標準品比對和二級質譜確證，同時參考相應文獻進行確認。定量分析時，采用Full MS-SIM及Targeted-MS2掃描方式采集信號，Targeted-MS2掃描方式下分別對黃芩素和漢黃芩素的母離子和子離子的提取離子流圖積分，通過峰面積計算含量。在黃芩藥材中檢出黃芩素、漢黃芩素、韌黃芩素Ⅱ、二羥基-二甲氧基黃酮、5，7，2′，5′-四羥基-8，6′-二甲氧基黃酮和SkullcapflavonⅡ的[M+H]+峰。定量分析結果顯示，黃芩素(m/z271.06→ 123.01)的線性范圍為49.7～447.3 ng，相關系數(r2)為0.995，平均加標回收率為87.0%；漢黃芩素(m/z285.07→270.05)的線性范圍為50.0～350 ng，r2為0.995，平均加標回收率為66.0%。該方法可用于黃芩藥材的快速定性檢測和定量分析。

實時直接分析(DART)；Orbitrap質譜；黃芩；快速分析

黃芩是一種應用廣泛的常用中藥,中國藥典規定的正品為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根。現代醫學證明黃芩具有清熱解毒、抗炎、降壓、減輕組織的缺血損傷、清除氧自由基、抗氧化、調節免疫等作用。藥理研究表明,黃酮類化合物是黃芩的主要有效成分,在黃芩中已發現的41 種黃酮類化合物中,含量較高并具有明顯藥理作用的是黃芩苷(Baicalin)、黃芩素(Baicalein)、漢黃芩苷(Wogonoside)和漢黃芩素(Wogonin) 4種[1-2]。

2010版中國藥典利用薄層色譜法以黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素為對照品對黃芩藥材進行定性鑒別，利用高效液相色譜法測得黃芩苷含量作為定量依據。但薄層色譜法的操作較繁瑣，有機溶劑消耗量大，高效液相色譜法則對實驗條件要求較高，且色譜分離過程需花費大量時間。在傳統中藥材的質量控制中常選用一種或多種特定的化學成分作為定性定量分析標記物，篩選標記物的原則是選取含量較高且具有特定生物活性的成分[3-5]。然而，中藥材化學成分高度復雜的特性增加了色譜分離時間并使得前處理更復雜，因此需要更加高通量的方法對中藥材進行質量控制。

實時直接分析[6](Direct analysis in real time,DART)離子源是一種新型的敞開式大氣壓電離技術，在2005年由Cody等[7]首次提出，同年由JOEL和IonSense公司將其商業化。這種電離技術不需對樣品進行復雜的前處理，能在數秒內分析存在于氣體、液體、固體或材料表面的化合物，對樣品消耗量較低，分析過程中無需大量的有機溶劑。DART可與多種質譜儀聯用，如飛行時間質譜、四極桿質譜、離子阱質譜等，應用于食品安全、爆炸物的檢測、藥品非法添加等方面[7-8]。朱洪斌等[9]利用DART-MS建立了快速檢測烏頭炮制品有效成分的方法，但該方法在中藥材快速定性和定量方面的應用特別是同時定性定量多種成分的研究相對較少[10]。本研究以黃芩為例，運用DART-Orbitrap質譜技術嘗試建立了一種對含黃酮類成分中藥材快速檢測的方法。

1　實驗部分

1.1主要儀器、材料與試劑

DART離子源(自動滑軌，十孔載樣器，載樣篩網)購于美國Ion Sense公司；Q-Exactive Orbitrap質譜儀(Xcaliber工作站)購于美國賽默飛世爾公司。

甲醇(分析純，北京化工廠)；高純氮氣、氦氣(純度>99.999%，長春巨洋氧氣廠)；黃芩素(北京北納創聯生物技術研究院，批號：130115)，漢黃芩素(北京北納創聯生物技術研究院，批號：130203)；黃芩藥材由長春中醫藥大學中藥鑒定實驗室提供。

1.2檢測條件

DART條件：參考本實驗室前期工作[10-11]，選擇離子化氣體為氦氣，待機氣體為氮氣，氣體壓力為0.5 MPa，氣體溫度為300 ℃，其他參數采用儀器默認設置。定性鑒別采用玻璃管蘸取樣品進行檢測，定量分析采用篩網方式進行檢測，載樣器滑動速度為0.2 mm/s，正離子模式采集。

Orbitrap質譜條件：掃描范圍m/z50～750，分辨率為35 000，AGC Target 1×10-6(Automatic gain control)，正離子模式掃描，碎裂電壓黃芩素為NCE 80、漢黃芩素為NCE 50。DART離子源與質譜入口之間的距離為1 cm。

1.3樣品制備

分別配制0.994 mg/mL黃芩素標準品溶液與1 mg/mL漢黃芩素標準品溶液作為儲備液。稱取黃芩粉末0.5 g，置于5 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲提取40 min，用甲醇補足至刻度，取上清液作為供試品。定性檢測時用熔點管蘸取樣品進樣，每次檢測時間為6 s；定量檢測時用移液槍吸取樣品點在載樣篩網上進行檢測，滑動速度為0.2 mm/s，每個樣品重復檢測3次。

圖1　黃芩素和漢黃芩素的離子強度隨溫度的變化曲線Fig.1　Signal intensities of baicalein and wogonin ion on different helium gas temperatures

2　結果與討論

2.1載氣溫度的選擇

以熔點管進樣方式分別測試了100～450 ℃范圍內(50 ℃為梯度)黃芩素與漢黃芩素的響應值與載氣溫度變化的關系(如圖1)，測得最佳離子化溫度為300 ℃[13]。在較低載氣溫度下兩種待測組分的信號強度均很弱，黃芩素在200 ℃以下，漢黃芩素在100 ℃時幾乎無響應信號，另據多篇文獻報道，不同類別化學物亦出現此情況[5,13-14]。由于高溫有利于待測物質去溶劑化并轉移到氣相中[7]，故在達到最大響應值前(黃芩素為400 ℃，漢黃芩素為300 ℃)信號強度隨溫度的增高而增強。然而過高的溫度會使樣品分解與碳化，因此出現信號強度值隨溫度升高而下降的區段。考慮到溫度對各檢測指標的影響，實驗選定300 ℃為離子化溫度。

2.2碎裂電壓的選擇

以熔點管進樣方式分別優化黃芩素與漢黃芩素的碎裂電壓(NCE，30～80 eV)，測得黃芩素和漢黃芩素的最佳碎裂電壓分別為 80 eV和50 eV。在給定NCE電壓(80 eV)條件下可觀察到相對豐度較大的黃芩素(圖2A)的[M+H]+m/z271.06 和子離子峰m/z123.01，而對于漢黃芩素(圖2B)，高NCE電壓下難以觀察到其[M+H]+峰，故選用低于黃芩素的碎裂電壓50 eV。

圖2　黃芩素(A)和漢黃芩素(B)的串聯質譜圖Fig.2　DART tandem mass spectra of baicalein(A) and wogonin(B)

2.3定性檢測

用熔點管蘸取黃芩提取液置于氦氣流中，用Orbitrap 質譜采集信號(如圖3A)。在質譜圖中可以看到黃芩素的[M+H]+峰(m/z271.06)以及漢黃芩素的[M+H]+峰(m/z285.07)，此外還可觀察到m/z301.07，315.08，347.07，375.10等特征峰。黃芩中主要含有黃酮類化合物[14]，通過對比發現，質子化的韌黃芩素Ⅱ、二羥基-二甲氧基黃酮、5，7，2′，5′-四羥基-8，6′-二甲氧基黃酮和黃芩新素Ⅱ的精確分子量與上述特征峰一致。 對黃芩素的[M+H]+離子(m/z271.06)和漢黃芩素的[M+H]+離子(m/z285.07)進行碎裂，結果如圖2所示，利用串聯質譜進一步對目標峰進行確定，增強了黃芩藥材鑒別的準確性，因此可用上述6個特征峰結合黃芩素與漢黃芩素的串聯質譜圖對黃芩藥材進行定性鑒別。另外，對黃芩藥材進行直接檢測，將黃芩飲片切開，切面置于離子化區域，按“1.2”條件進行一級質譜檢測(圖3B) 。對比黃芩提取液的質譜圖(圖3A)可以看出，上述6種特征峰均存在，在用黃芩藥材直接檢測時，信號強度降低，但對于藥材的定性鑒別影響不大。實驗結果表明DART-MS技術可對黃芩進行定性檢測，與傳統的薄層色譜方法相比，具有速度快、節省有機溶劑、無需樣品前處理等優點。

圖3　黃芩提取液(A)和黃芩藥材(B)的DART-MS譜圖Fig.3　DART mass spectra of extracted solution(A) and Scutellaria Radix medicinal material(B) of Scutellaria Radix

2.4定量檢測

依據2010版《中國藥典》對黃芩藥材的規定，選取黃芩苷作為定量檢測的指標。在本實驗中難以檢測到黃芩苷離子峰，可能是由于糖苷類化合物的揮發性較弱，在檢測溫度下無法使其轉移到氣相進入質譜被檢測，這與前期研究結果相符[9]，所以選取黃芩素和漢黃芩素作為定量指標。采用Targeted-MS2掃描模式，分別對黃芩素(m/z271.06→123.01)和漢黃芩素(m/z285.07→270.05)的母離子與子離子的提取離子流圖積分，通過峰面積計算含量。該方法對黃芩素和漢黃芩素的檢出限(S/N=3)分別為0.497 ng和0.500 ng。

2.4.1線性關系精密吸取黃芩素對照品儲備液適量，配成質量濃度為49.7 μg/mL的對照品溶液，分別吸取上述對照品1，2，3，4，5，6，7，8，9 μL，點樣在篩網上，以載樣器滑動速度為0.2 mm/s進行檢測。以峰面積(Y)對標準品質量(X,ng)進行回歸分析。結果表明，黃芩素在49.7～447.3 ng范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=2.89×106X-1.43×108，r2=0.995。

精密吸取漢黃芩素對照品儲備液適量，配成質量濃度為50 μg/mL的對照品溶液，同法測定并進行回歸分析。結果表明，漢黃芩素在50.0～350 ng范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=5.76×106X-1.20×107，r2=0.995。

2.4.2回收率取已測定含量的黃芩藥材，按照“1.3”方法制備供試品溶液，分別吸取3 μL供試品溶液5份點樣于載樣篩網上，待溶劑揮干后再分別吸取3 μL濃度為49.7 μg/mL的黃芩素對照品溶液點樣于載樣篩網上，將篩網置于滑軌上按黃芩素檢測條件進行檢測。測定黃芩素的含量，計算得其加標回收率為82%～95%，平均加標回收率為87.0%，加標回收率結果良好。

另分別吸取3 μL供試品溶液5份點樣于載樣篩網上，待溶劑揮干后再分別吸取3 μL濃度為50 μg/mL的漢黃芩素對照品溶液點樣于載樣篩網上，將篩網置于滑軌上按漢黃芩素檢測條件進行檢測。測定漢黃芩素的含量，計算得其回收率為59%～72%，平均加標回收率為66.0%，加標回收率結果良好。

2.4.3精密度取黃芩素對照品溶液5 μL，點樣至篩網上，按“1.2”條件進行檢測，重復檢測6次，以黃芩素母離子m/z271.06和子離子m/z123.01提取離子流圖的峰面積計算[15]，相對標準偏差(RSD)為9.0%。以漢黃芩素母離子m/z285.07和子離子m/z270.05提取離子流圖的峰面積計算，漢黃芩素的RSD為8.9%。表明儀器的精密度良好。

2.4.4重復性分別取5份供試品溶液各5 μL，點樣至篩網上，按“1.2”條件進行檢測。以黃芩素提取離子流圖的峰面積計算RSD為12.3%，漢黃芩素提取離子流圖的峰面積計算RSD為9.8%，表明該方法的重復性良好。

3　結　論

本實驗采用DART離子源結合Orbitrap高分辨質譜對黃芩進行檢測，建立了一種快速定性定量分析黃芩的方法。在定性鑒別時無需對樣品進行前處理，直接將藥材置于離子化區域，通過質譜信號的精確分子量進行定性鑒別。與傳統的性狀鑒別和顯微鑒別等快速鑒別手段相比，DART-Orbitrap質譜法更加準確可靠，減少了人為因素對實驗的干擾，多種成分同時檢測提高了定性分析的準確性；定量分析結果表明，本方法具有良好的精密度，但準確度與HPLC法相比有一定差距。該方法適用于復雜基質條件下對中藥的指標性成分進行快速分析，方法準確、快速、簡便、綠色，可為中藥材、飲片以及中成藥的分析和質量控制提供方法參考。

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Rapid Analysis of Scutellaria Radix by Using DART Coupled with Orbitrap Mass Spectrometry

LI Le-le1，GUO Yun-long1，LIU Wen-long1，LI Zhuo2，WANG Yang1，LIU Shu-ying1,3*

(1.Jilin Ginseng Academy,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun130117，China；2.The Affiliation Hospital to Changchun University of Chinese Medicine,Changchun130021，China；3.Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Changchun130022，China)

A DART coupled with Orbitrap mass spectrometric method was developed for the qualitative and quantitative analyses ofscutellariaradix.The component was identified by comparing with standard component and the report of relative researches as well as the full scan spectra and secondary spectra.In quantitative analysis,the Full MS-SIM and Targeted-MS2mode was applied to obtain the mass spectrum,extract ion chromatography based on the parents ion and the product ion of baicalein(m/z271.06→123.01) and wogonin(m/z285.07→270.05) were used for quantitative analysis in the Targeted-MS2mode.The signals of baicalein,wogonin,SkullcapflavonⅡ and other components were observed in the mass spectra ofscutellariaradix.The linear ranges of baicalein and wogonin were 49.7-447.3 ng(r2=0.995) and 50.0-350 ng(r2=0.995),respectively.Their average recoveries were 87.0% and 66.0%,respectively.This method is suitable for the rapid analysis ofscutellariaradixand other traditional Chinese herbal medicines.

direct analysis in real time(DART); Orbitrap mass spectrometry;ScutellariaRadix; rapid analysis

2015-11-03；

2016-01-11

農業部公益性行業基金(201303111)

劉淑瑩，博士，研究員，研究方向：有機質譜學，Tel:0431-86045155，E-mail:syliu@ciac.ac.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.014

O657.63; TQ460.72

A

1004-4957(2016)07-0859-05