適體熒光分析法檢測養殖廢水中四環素類抗生素

趙秋伶,張尤華,于曉艷

(遼寧工程技術大學　礦業技術學院，遼寧　葫蘆島　125105)

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適體熒光分析法檢測養殖廢水中四環素類抗生素

趙秋伶*,張尤華,于曉艷

(遼寧工程技術大學礦業技術學院，遼寧葫蘆島125105)

建立了核酸適體識別-熒光探針技術檢測養殖廢水中土霉素、四環素、金霉素及強力霉素4種四環素類抗生素(TCs)總殘留量的新方法。兩段DNA對TCs共同識別后折疊成穩定的 “發卡型” 雙鏈結構，核酸染料4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)能插入“發卡”部位產生熒光信號發射，據此可實現對TCs的定量檢測。在最優實驗條件下，以土霉素為目標分子建立工作曲線，在10～50 nmol/L范圍內，熒光強度與對應濃度呈良好線性關系，土霉素的檢出限為2.3 nmol/L。用四環素、土霉素、金霉素和強力霉素分別進行加標回收實驗，平均回收率為88.5%～102.3%，相對標準偏差(n=5)為3.2%～6.7%。5個養殖場水樣中均有TCs檢出，檢出量在7.6～42.7 nmol/L之間。該方法簡單、靈敏、快速，可滿足養殖場廢水中TCs總殘留量的測定要求。

核酸適體；熒光分析法；四環素類抗生素；快速檢測；廢水

四環素類抗生素(TCs)是由放線菌產生的一類廣譜抗菌素，其結構中含有并四苯基本骨架，在酸性和堿性條件下均不穩定[1]。TCs主要品種有土霉素、四環素、金霉素、強力霉素等。TCs被廣泛用作獸藥，同時又作為一種生長促進劑被添加到飼料中用于畜牧業、漁業等[2]。TCs在畜禽體內難以被腸胃吸收，約 30%～90% 以母體化合物的形態排出，殘留于糞便、尿液及養殖水體中，并進入土壤、地表水及地下水等環境受體中，給人類健康造成潛在危害[3]。我國TCs的用量每年達數千噸，濫用、違規使用和使用不當的情況非常嚴重。因此必須加強對食品和養殖業廢水中TCs殘留的檢測和監測力度，發展快速靈敏的檢測方法。

核酸適體是人工合成的單鏈寡核苷酸(DNA 或RNA)[4]，有化學抗體之稱，并具有抗體所不具備的優點，如易合成，易引入修飾基團用于標記和固定化，具有高親合力和良好的穩定性等[5-7]。適體作為新的識別元素極大地促進了生物傳感器的發展。土霉素(OTC)的核酸適體已被成功篩選[8]，具有良好的特異性及親和力，目前多種基于適體檢測OTC 的方法已被報道，如電化學、納米金、酶聯等[9-11]。適體作為識別元素的傳感器滿足簡便、快速、經濟的要求，且靈敏度高、特異性好，尤其適合發展現場的實時檢測[12-14]。適體傳感器彌補了傳統儀器分析法的不足，但仍存在缺陷，如適體檢測OTC的傳感體系是簡單水樣，直接應用于實際試樣時仍存在困難。

2014年，Gu課題組[15]將76-堿基序列的 OTC 核酸適體優化成 8-堿基序列的短鏈核酸適體(5′-CGGTGGTG-3′)，基于金納米粒子比色分析法檢測 OTC 時，靈敏度提高了500倍，并且該核酸適體對四環素、金霉素和強力霉素均具有良好的親和力。本研究以此核酸適體作為識別元素，建立了基于適體構象變化的熒光傳感器，快速、靈敏檢測了養殖廢水中土霉素、四環素、金霉素和強力霉素的總殘留量。本方法采用微孔板上固定的 DNA 識別目標分子，因識別和檢測分開進行，有效地排除了試樣中的熒光物質對檢測信號的干擾，實現了復雜試樣中TCs的熒光分析檢測。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

黑色96 微孔板(康寧)；親和素、牛血清白蛋白(BSA)及四環素、土霉素、金霉素、強力霉素均購于美國 Sigma 公司，土霉素、四環素、金霉素和強力霉素使用前以甲醇配成0.1 mmol/L的儲備液；核酸外切酶Ⅰ(E.coliExonucleaseⅠ)購自大連寶生物工程有限公司；DNA(1)序列(5′-Biotin-TTAAAGGTG-3′)，DNA(2)序列(5′-CGGTTTTA-3′)均由上海生工生物工程公司合成，經HPLC純化后，用超純水配成100 μmol/L儲備液；緩沖溶液(碳酸鹽緩沖液：0.5 mol/L，pH 9.0；PBS緩沖液：0.1 mol/L，pH 7.4；PBST緩沖液：0.1 mol/L，pH 7.4，含2 mmol/L MgCl2和0.12% Tween 20；結合緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，含100 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，0.02% Tween 20)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，1 mg/mL，乙醇)購自美國Invitrogen 公司，使用前以結合緩沖液稀釋100倍；養殖廢水采自錦州北鎮的規模化養殖場；其它試劑為分析純。實驗用水為超純水(Milli-Q制備,18.2 MΩ·cm)。

1.2實驗方法

1.2.1微孔板包被親和素親和素用碳酸鹽緩沖液稀釋至適當濃度,每孔包被100 μL，4 ℃反應12 h后,用PBST緩沖溶液清洗數次，每次5 min，拍干。最后用1% BSA 封閉孔板，反應1 h后，用PBST洗滌3次。

1.2.2DNA固定至微孔板實驗在PBS緩沖液中進行，首先向PBS中加入檢測DNA(1)，配成合適濃度。親和素包被的微孔板凹槽用200 μL PBST洗滌3次，每次5 min。然后在微孔板的每個凹槽中加入100 μL DNA(1)，置于37 ℃搖床反應2 h。將DNA(1)的5′端是生物素標簽，通過生物素與親和素的特異相互作用，將DNA(1)固定到親和素包被的微孔板的凹槽。凹槽用200 μL PBST洗滌3次，每次 5 min，以去除未反應或吸附的DNA。然后加1% BSA做封閉反應，反應1 h，反應完畢用PBST洗滌3次。檢測DNA(1)包被的微孔板立即用于下步反應。

1.2.3識別反應與工作曲線的建立OTC標準溶液用結合緩沖液稀釋成系列濃度，分別加入到包被了檢測DNA(1)的微孔板中,每孔100 μL，同時加入DNA(2)，保證其濃度相對于DNA(1)略過量，室溫孵育40 min，DNA(1)和DNA(2)與OTC充分反應。在反應液中加入1.0 μL核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ，5 U/μL)和11 μL 10×Exo Ⅰ緩沖液，37 ℃孵育30 min，未與OTC作用的DNA(1)和DNA(2)被Exo Ⅰ水解，反應完畢，倒掉反應液，用200 μL PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min。然后在微孔板凹槽中加入100 μL 適當濃度的核酸染料(DAPI)，室溫孵育10 min。用酶標儀測定熒光光譜。DAPI的激發和發射波長分別為358 nm和461 nm。未加入OTC前,測得熒光強度為IF0；加入OTC后,測得熒光強度為IF，以IF定量分析OTC濃度，并繪制工作曲線。

1.2.4加標回收實驗將4 ℃保存的自家養魚廢水離心取上清液，向樣品中分別添加10.0，30.0 nmol/L的四環素、土霉素、金霉素和強力霉素標準液，室溫下放置過夜后，再次離心，取上清液。用建立的方法檢測熒光強度，根據工作曲線計算回收量，同時計算回收率及相對標準偏差。

1.2.5養殖場廢水中TCs總殘留的檢測取錦州北鎮規模化養殖場的養殖廢水，離心取上清液，用建立的方法檢測熒光強度，再根據工作曲線計算檢出量。

2　結果與討論

2.1實驗原理

自動化系統的主要功能為：數據采集、傳輸和處理。通過端站的傳感器和執行端完成數據的采集和命令執行；各站的數據通信設備完成數據傳輸任務；最后由監控中心站的微機系統完成數據處理工作，包括數據識別、校驗、存貯和分析，并將處理后的數據和結果進行顯示、存儲和打印。

實驗原理如圖1 所示，黑色微孔板上固定的DNA(1)序列(5′-Biotin-TTAAAGGTG-3′)經專門設計,其5′端帶有生物素標簽，通過生物素與親和素的特異相互作用，被固定到親和素包被的微孔板上。DNA(2)序列(5′-CGGTTTTA-3′)也經專門設計。DNA(2)中的TTTA和DNA(1)中的TAAA反向互補，在溶液中存在平衡反應。DNA(2)和DNA(1)的粗體序列合在一起為TCs的核酸適體，識別TCs后DNA(2)和DNA(1)發生構象轉換并形成穩定的“發卡型”雙鏈結構(圖中DNA-TCs)，不再被外切核酸酶Ⅰ(Exo Ⅰ)水解，核酸染料DAPI插入雙鏈的小溝中間，產生熒光信號發射；無TCs時，微孔板上固定的DNA(1)和游離的DNA(2)被Exo Ⅰ剪切，“發卡型”雙鏈結構不存在，DAPI無法插入，無熒光信號發射。Exo Ⅰ是單鏈特異性3′→5′核酸外切酶，可特異性地提高檢測信號，同時降低背景及噪音信號，提高分析的靈敏度。由于本研究檢測的是成分復雜并發射一定強度熒光信號的養殖廢水體系[16],將DNA(1)固定到微孔板后，能實現高效快速分離，有效去除非特異性干擾，進而試樣中的復雜成分及熒光成分對檢測信號均不產生影響，提高了檢測靈敏度。

圖1　傳感器的原理圖Fig.1　Schematic illustration of the sensor

2.2實驗條件的優化

2.2.1微孔板包被親和素濃度的優化生物素DNA通過與包被于微孔板上的親和素之間的特異性結合固定于微孔板上，適合的親和素包被濃度是實驗成功的基礎。考察了親和素包被濃度分別為10，20，30，40，50，60，70 mg/L時,包被前后溶液在280 nm處吸光度值的減少量ΔA(ΔA=A1-A2)(A1為包被前，A2為包被后)。結果顯示,在親和素包被濃度為50 mg/L時,吸光度值減少最為明顯,表明此時微孔板已被親和素飽和。因此,親和素包被濃度采用50 mg/L。

2.2.2DNA(1)包被濃度的優化固定親和素包被濃度為50 mg/L，在過量DNA(2)存在時，考察了濃度分別為20，30，40，50，60，70 nmol/L 的DNA(1)包被微孔板后，與500 nmol/L的OTC發生識別反應后的熒光強度。結果顯示，DNA(1)包被濃度為40 nmol/L時，461 nm波長處的熒光強度最大，表明此時微孔板包被的DNA(1)最多。因此，選擇DNA(1)包被濃度為40 nmol/L。

2.2.3DAPI用量的優化固定親和素包被濃度為50 mg/L，DNA(1)包被濃度為40 nmol/L，在過量DNA(2)存在時，與500 nmol/L的 OTC 發生識別反應形成“發卡型”雙鏈結構后，分別與不同濃度DAPI(0.01，0.1，10，50 μmol/L)孵育10 min，測定熒光強度。結果顯示 DAPI 濃度為 10 μmol/L時,461 nm波長處的熒光強度最大，此后隨著DAPI 濃度增加熒光強度不再增加，說明此時反應已飽和。因此，DAPI 濃度采用 10 μmol/L。

2.2.4Exo Ⅰ用量的優化當 DNA(1)包被濃度為40 nmol/L，DNA(2)濃度為40 nmol/L時，未做識別反應，DNA(1)和DNA(2)直接被Exo Ⅰ水解，考察了 Exo Ⅰ 用量分別為0.5，0.8，1.0，1.2，1.5，1.8 μL(5 U/μL)時，檢測體系在461 nm處的熒光強度。結果顯示：隨著Exo Ⅰ用量的增加，體系熒光強度降低，當Exo Ⅰ用量增至1.0 μL時，體系熒光強度降至最低，說明此時 Exo Ⅰ 用量已足夠。因此，本實驗選擇 Exo Ⅰ 的用量為1.0 μL。

圖2　DNA傳感器與不同濃度的OTC作用后的熒光光譜Fig.2　Fluorescence spectra of DNA sensing system in presence of various concentrations of OTC concentrations of OTC(from a to j):0,10,15,20, 30,40,50,100,200,500 nmol/L； λex=358 nm,λem=461 nm

圖3　461 nm處的熒光強度與OTC濃度的關系曲線Fig.3　Linear relationship between fluorescence intensity in 461 nm and OTC concentration

2.3線性范圍與檢出限

在最佳實驗條件下，測定不同濃度OTC與適體傳感器作用后的熒光光譜。結果如圖2 所示，隨著OTC濃度的增加，461 nm處的熒光強度逐漸增大。根據461 nm處的光譜數據繪制出熒光強度與OTC濃度的關系曲線(圖3)。結果顯示，在10～500 nmol/L范圍內，隨著體系中OTC 濃度的逐漸增加，溶液的熒光強度迅速增大，之后趨于緩慢。在10～50 nmol/L 范圍內，體系的熒光強度(IF)與 OTC 濃度(c,nmol/L)呈良好的線性關系(圖3插圖)，回歸方程為IF=1 603c+3 593，相關系數(r)為0.985 6，檢出限(3σ/n)達2.3 nmol/L。

考察了10～50 nmol/L濃度范圍內，其它四環素體系熒光強度與其濃度的關系。實驗結果表明：在相同條件下，用上述建立的方法測定四環素、金霉素和強力霉素時，在10～50 nmol/L 范圍內，體系的熒光強度與濃度也呈良好的線性關系，線性方程分別為IF=1 579c+3 586，IF=1 586c+3 574和IF=1 629c+3 591，檢出限分別為 2.1，3.2，3.6 nmol/L。由于4種化合物的線性方程相似，為了簡化處理，后續實驗以土霉素為目標分子建立的標準曲線為工作曲線，近似驗證該方法的適用性。

2.4回收實驗

選擇自家養魚廢水進行加標回收實驗，加標水平分別為10，30 nmol/L，四環素、土霉素、金霉素和強力霉素的回收率和相對標準偏差見表1。4種目標分析物的平均回收率為88.5%～102.3%，相對標準偏差(n=5)為3.2%～6.7%。表明本方法的準確度和靈敏度良好。同時養殖廢水中加標回收實驗結果與純水中的加標回收數據一致,說明養殖廢水中可能出現的復雜成分(鈉、鉀、氯、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鈣離子等無機物質；尿素、尿激酶、表皮生長因子、生長激素等有機物質[16])對TCs的檢測無影響，表明該方法對TCs的檢測具有良好的特異性。

表1　回收率實驗結果(n=5)

2.5實際樣本的檢測

應用本方法檢測錦州北鎮5個規模化養殖場(1#，2# 和3# 是養豬場,4# 和5# 是養雞場)采集的廢水，結果均檢出四環素類抗生素殘留，總殘留濃度為7.6～42.7 nmol/L。

3　結　論

基于核酸適體構象變化及 Exo Ⅰ 輔助的信號放大策略，構建了適體熒光傳感器用于TCs總殘留的檢測。在優化實驗條件下，熒光強度與TCs濃度在10～50 nmol/L范圍內呈良好的線性關系，檢出限不高于3.6 nmol/L。該方法簡單，結果準確，可滿足養殖場廢水中TCs總殘留量的測定，同時滿足大批量樣品和現場快速檢測的要求。適體構象變化形成“發卡”結構的結合模式也為其它物質的檢測和傳感器的設計提供了新思路。

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Detection of Tetracycline Antibiotics in Aquaculture Wastewaterby DNA-based Fluorescence Assay

ZHAO Qiu-ling*,ZHANG You-hua,YU Xiao-yan

(College of Mining Industry Technology，Liaoning Technical University，Huludao125105，China)

A novel analysis method based on specific recognition of aptamer and fluorescence probe technique was established for the detection of total residues of tetracycline antibiotics(TCs)，including oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline and doxycycline etc.in aquaculture wastewater.Two segments of DNAs work together to identify TCs to fold into a stable “hairpin” double chain structure that can be inserted by nucleic acid dye DAPI to generate of fluorescence emission.Based on this,TCs can be quantified.Under the optimal experimental conditions,the working curve was established with oxytetracycline as target molecule,the fluorescence intensity showed a good linear relationship with concentration of oxytetracycline in the range of 10-50 nmol/L,and the detection limit of oxytetracycline was 2.3 nmol/L.When having oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline and doxycycline as additives,the average recoveries ranged from 88.5% to 102.3%,with relative standard deviations(n=5) of 3.2%-6.7%.The method is simple,sensitive and rapid,and could satisfy the requirements for determination of total TCs residues in the farm wastewater.

aptamer；fluorescence analysis；tetracyclines；rapid detection；wastewater

2016-01-31；

2016-02-18

國家自然科學基金資助項目(21506087)

趙秋伶，博士，講師，研究方向：化學生物學與食品安全分析，Tel:0429-5310568，E-mail:flyzhql@iccas.ac.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.016

O657.6；R978.1

A

1004-4957(2016)07-0869-05