法舒地爾對肺動脈高壓血管重塑中ROCK及ET—1活性的影響

陳小軍+邢銀花+陳其章+王紅娟

【摘要】 目的 探討法舒地爾對肺動脈高壓（PAH）血管重塑中ROCK及內皮素-1（ET-1）活性的干預作用。方法 42只大鼠， 隨機分為空白對照組（C組， 7只）、PAH模型組（P組， 7只）、生理鹽水組（NS組， 14只）、法舒地爾組（ROCK組， 14只）。注射野百合堿建立大鼠肺動脈高壓模型， ROCK組于第28天開始注射法舒地爾， 治療4周；P組無干預；NS組注射生理鹽水。干預結束后測量、觀察各項指標。結果 ROCK組和指標與其他組相比， 干預效果明顯較好（P<0.05）。結論 法舒地爾在肺動脈高壓血管收縮和重建中可有效抑制ROCK， 并降低ET-1活性， 有效降低肺動脈壓力。

【關鍵詞】 法舒地爾；肺動脈高壓；血管重塑

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.21.159

PAH是心血管常見疾病之一， 是因為肺血管的增生及重構導致肺血管阻力進行性增高的致命性疾病。以往研究證明ROCK信號通路參與了肺血管的收縮和重建， 但是PAH確切的發生機制尚未完全明確。本研究力求進一步明晰法舒地爾在肺血管的收縮和重建中的作用和作用機理， 提高對肺動脈高壓發病機制的理解， 希望能為預防和治療肺動脈高壓提供臨床依據。

1 材料與方法

1. 1 材料 清潔級健康雄性Sprague—DaWley大鼠42只， 體重180～248 g， 適應性喂養7 d后， 隨機分為C組7只、P組7只、NS組14只、ROCK組14只。

1. 2 肺動脈高壓動物模型的建立及干預 將野百合堿（Sigma公司， 美國）溶解于1 mol/L稀鹽酸溶液， 以1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至pH7.2， 最后用生理鹽水配制成1%溶液， 在大鼠頭頸部皮下一次性注射野百合堿50 mg/kg。4周后野百合堿誘導的肺動脈高壓模型建立成功， 即P組；C組給予普通飼料喂養， 自由進食飲水。NS組于腹腔注射等體積生理鹽水， 直至第8周末；ROCK組于第28天開始腹腔注射法舒地爾（日本旭化成制藥株式會社， 國藥準字H20050331， 產品生產批號：ERSllMM）15 mg/（kg·d）至第8周末。

1. 3 方法 ①大鼠肺動脈平均壓（mPAP）的測定：注射野百合堿后第4、8周末各自停止用藥2 d， 以10%水合氯醛30 ml/kg

腹腔內注射麻醉， 采用右心導管測壓方法經右頸外靜脈插管至肺動脈和右心室， 肝素化后用RM-6240B/C多導電生理記錄儀（成都儀器廠）測定mPAP；②組織學觀察：留取肺組織， 備提取蛋白。固定于10%中性福爾馬林溶液中2 d， 常規處理， 備用于HE染色和ROCK蛋白免疫組化。測定直徑75～150 μm的肺動脈血管壁厚度占血管外徑的百分比（WT%）及管壁面積占血管總面積的百分比（WA%）；③免疫組化分析肺組織中ROCK蛋白表達；④提取蛋白及免疫印跡（Western blot）半定量分析ROCK-1、pMYPT-1及MYPT-1蛋白表達；⑤半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測mRNA表達。

1. 4 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數 ± 標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

①大鼠基本情況：大鼠于注射野百合堿后第21天左右逐漸出現進食、飲水減少、毛發枯燥、體質下降、活動減少等癥狀， 至第8周末情況更加嚴重， 甚至出現右心衰竭和死亡。實驗結束后， C組、P組大鼠均存活， NS組存活4只（4/14）， ROCK組存活11只（11/14）。ROCK組與NS組相比， 動物死亡比率較低（P<0.05）， 大鼠基本情況明顯較好。②mPAP：注射野百合堿后第4周末， C組為（20.3±1.8）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）， P組為（36.2±2.4）mm Hg， P組顯著高于C組（P<0.05）， 表明肺動脈高壓建模成功。第8周末， NS組為（39.7±1.8）mm Hg， ROCK組為（26.2±2.3）mm Hg， NS組進一步高于P組， 但ROCK組顯著低于NS組（P<0.05）。③大鼠肺小動脈形態學觀察：C組、P組、NS組、ROCK組WT%分別為（13.3±3.4）%、（25.6±5.3）%、（28.2±4.4）%、（15.6±2.8）%；WA%分別為（38.4± 2.8）%、（60.3±2.5）%、（68.8±1.6）%、（40.3±2.8）%。C組大鼠肺小動脈血管內皮細胞連續、均勻的分布， 大小一致， 厚薄一致， 血管壁沒有增厚， 血管腔沒有狹窄。P組內皮細胞連續性變差， 中層平滑肌細胞肥大、排列混亂， 血管腔狹窄明顯， WT%與WA%明顯高于C組， NS組進一步高于C組， ROCK組明顯低于NS組（P<0.05）， 病變較輕。④ROCK-l蛋白表達水平：C組陽性信號指數（7.2±0.1）， P組為（17.4±0.2）， NS組為（20.6±0.2）， ROCK組為（12.3±0.1）。P組和NS組ROCK-l蛋白表達水平明顯高于C組， 但ROCK組表達水平明顯低于NS組（P<0.05）。⑤mRNA表達：C組mRNA表達量為（1.1±0.2）， P組為（1.6±0.1）， P組顯著高于C組， NS組為（1.6±0.3）， ROCK組為（1.2±0.1）， ROCK組顯著低于NS組（P<0.05）。⑥ET-1活性：C組、P組、NS組、ROCK組ET-1分別為（1.1±0.3）、（1.8±0.2）、（2.3±0.6）、（1.9±0.3）， P組較C組明顯升高， NS組進一步高于P組， 但ROCK組較NS組顯著下降。

3 討論

野百合堿可引發肺血管重構和內膜損傷， 導致PAH， 與人類PAH發病機制相似， 由其引發的PAH大鼠是比較理想的動物模型。野百合堿誘發的PAH大鼠ROCK-1蛋白表達顯著增多， 且比肺動脈內皮細胞上表達要多， 血管壁厚度增加， 管腔更狹窄， 本研究發現， 法舒地爾治療肺動脈高壓可使大鼠mPAP 降低， 右心室肥厚減輕， ROCK-l蛋白表達水平下降， 通過抑制ROCK-l活性， 平衡內皮細胞合成分泌ET-1水平， 進一步增強內皮介導的血管重建效應， 改善血管持續收縮， 改善PAH癥狀。

綜上所述， 法舒地爾在PAH血管收縮和重建中可抑制ROCK， 并降低ET-1活性， 有效降低肺動脈壓力， ROCK信號傳導通路的研究將成為PAH發病機制研究的新方向。

參考文獻

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[收稿日期：2016-04-28]