“溫度對酶活性影響”實驗的再探究

姚 舒

(首都師范大學生命科學學院 北京 100048) 張 勝 (廣東省深圳第三高級中學 518172)

1 實驗背景

1.1 酶的概念 在一定條件下，酶在生物體內或體外均可催化各種生化反應。它與一般催化劑的共性在于：都是通過降低化學反應的活化能而加速反應進行(圖1)；不能改變化學反應的平衡點；反應前后酶的質量、性質不變[1]。

1.2 溫度與酶催化反應的關系 酶催化底物反應以效應物與酶活性有關基團的碰撞—絡合—解離為基礎。從熱力學的角度看，對于一個酶分子而言，只存在 “有活性”與“無活性”兩種狀態，不具有連續性。只有當酶成為一個“ 群體”時，因受溫度與pH的影響，有些酶失活，有些酶仍有活性，才表現出來酶“群體”活性隨溫度或pH 變化的連續曲線[2]。酶的最適溫度并非酶的特征常數，并不固定，而與測定酶活力的時間長短有關，因為酶可以短時間內耐受較高的溫度。大多酶在40℃以上催化活力下降；60℃～70℃呈現可逆失活；70℃～80℃出現不可逆失活[1]。酶的變性有兩方面的原因：溫度和時間。在高溫下變性比較快，但在較低溫度下，變性也會緩慢發生[3]。在一般情況下，溫度對酶活性影響實驗中將自變量設定為溫度，由于時間較短，不考慮時間對實驗帶來的影響。

圖1 酶催化機理——降低反應所需活化能

2 實驗常見問題及改進

2.1 實驗原理不合理 在碘-淀粉溶液中，由于配合與吸附作用產生了藍色的淀粉—碘包合物。但是，當溶液溫度升高時，淀粉的螺旋構象會遭到破壞，導致無法繼續保持與碘的吸附狀態，藍色因此褪去[4]。因此，碘液不可在高溫下檢測淀粉。

2.2 實驗過程的改進 用列表顯示操作步驟會使學生一目了然，并在實驗過程中進一步驗證低溫、高溫對酶活性的影響。通過對實驗過程的再設計，可使學生實驗的成功率大大提高，并更為直觀地驗證酶的性質，豐富實驗教學內容[5]。另外，底物淀粉和酶必須保存在同一溫度中，防止淀粉和酶混合在一起溫度突然發生變化，影響在冰浴和沸水浴中唾液淀粉酶的活性[6]。

2.3 新方法的嘗試 有研究者嘗試運用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對反應后的樣本進行分離實驗，來探究溫度對酶活性的影響。由于蛋白酶活性在不同溫度和時間下強弱不同，使得底物蛋白被切割的條帶在聚丙烯酰胺凝膠上顯示的粗細不同，據此可以判斷酶活性的強弱[7]。該實驗設計中涉及的幾種實驗材料對于普通中學來說不容易獲得，且凝膠電泳裝置也并不常見，因此不適宜推廣。

3 溫度對酶活性影響的再探究

參考美國主流生物學教材《生物實驗手冊》[8]，采用兒茶酚溶液替代淀粉溶液設計探究實驗。

3.1 實驗原理 兒茶酚氧化酶從土豆提取液中獲得。由于兒茶酚溶液為無色，苯醌為棕色，通過觀察顏色變化來定性判斷反應進行的程度。同時，顏色的逐漸變化可利用吸光度定量得出。

3.2 實驗材料與方法 準備1%兒茶酚溶液、土豆提取液、冰箱、水浴鍋、試管架、試管。實驗過程如下：

(1)在40℃和80℃的水浴鍋水浴或室溫下以及4℃冰箱中放置1個試管架。

(2)取7支試管，并在試管上部依次編號1～7。

(3)取1管馬鈴薯提取液和1管1%兒茶酚溶液。

(4)如表1所示，將蒸餾水，pH緩沖液和馬鈴薯提取物添加到試管中，震蕩馬鈴薯提取液至懸浮狀態。

(5)將上述試管放在對應溫度的水浴或冰箱里，每支管在各自對應的溫度下靜置5 min預熱(預冷)。將1至4號試管放到試管架置于室溫環境中(約22℃)或者20℃的水浴鍋中。

(6)如表1所示，向2號以及4～7號試管添加1%兒茶酚溶液。立即記錄每支試管此時的顏色變化，并在表1中記錄。定性記錄顏色變化，范圍從0～5，0表示沒有顏色變化，5表示劇烈變化。

(7)在接下來的20 min，每隔5 min觀察記錄一次顏色的變化，每次觀察完要迅速將試管放回原來的位置(冰箱或水浴)。

(8)實驗完畢后，清理實驗臺和實驗材料，兒茶酚必須倒入專門的廢棄物容器中，不能直接倒入水池。

4 實驗討論

從表1可見，試管1和3不含底物，試管2雖然有底物，不含酶。因此，試管1、2、3不會發生變化，保持原來的透明無色不變；試管4、5、6、7中的底物和酶完全相同，溫度為自變量。兒茶酚氧化酶對溫度敏感，最適溫度為15℃，到45℃就完全失活。也有文獻報道22℃為兒茶酚氧化酶的最適溫度[9]，反應條件可能有所差異。需要注意的是，在加入兒茶酚氧化酶之前需提前預熱反應系統到設定溫度，減少酶加入之后還未達到預設溫度從而產生誤差。