多拷貝畢赤酵母表達豬胰島素前體的動力學模型

陳　麗，王　玥，郭美錦，儲　炬，莊英萍

（1江蘇省農業科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京 210014；2華東理工大學，上海生物制造技術協同創新中心，上海 200237）

?

研究簡報

多拷貝畢赤酵母表達豬胰島素前體的動力學模型

陳麗1，2，王玥2，郭美錦2，儲炬2，莊英萍2

（1江蘇省農業科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京 210014；2華東理工大學，上海生物制造技術協同創新中心，上海 200237）

以攜帶多拷貝豬胰島素前體（PIP）基因的畢赤酵母（Pichia pastoris）為供試菌株，對分批補料發酵PIP合成動力學模型進行研究。建立了不同拷貝數畢赤酵母發酵合成PIP的菌體生長、產物合成和底物消耗的動力學模型，并通過Origin8.0軟件對模型參數進行了非線性擬合。根據動力學模型結果發現，隨著拷貝數的增加與菌體生長相關的產物系數α和細胞生長代謝系數k1絕對值不斷增加，12拷貝時PIP表達量達到最高，說明只有進一步促進高拷貝菌株細胞生長并減少其代謝負擔才能更有效地提高產物的生成速率。 同時表明：預測值與實驗值有良好的擬合性，所建模型能較好地反映分批補料發酵過程PIP的合成。

重組畢赤酵母；豬胰島素前體表達；拷貝數；動力學模型

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151432

引　言

胰島素（insulin）是體內調節能量代謝和糖代謝的重要激素，是治療I型糖尿病的特效藥物之一。大腸桿菌（Escherichia coli）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）都曾用于胰島素的工業化生產［1-2］。甲醇營養型畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種優秀的外源蛋白表達系統，它具有強有力的乙醇氧化酶基因啟動子（PAOX1）、外源蛋白表達量高、易于分離、外源基因穩定性高、培養基要求低和日臻成熟的高密度發酵工藝等特點［3-5］。畢赤酵母表達出的豬胰島素前體（porcine insulin precursor，PIP）經純化及體外轉肽可成為醫用人胰島素，該方法可為臨床提供大量質量可靠及價格低廉的重組人胰島素［6］。

基因劑量（gene dosage）是外源目的蛋白在重組畢赤酵母表達水平高低的重要影響因素之一。根據不同的外源蛋白特性，基因劑量對外源蛋白表達水平既有正的量效關系，也有負的量效關系，但是各自影響機理不盡相同［7-8］。目前用畢赤酵母表達PIP的報道較多停留在菌株的構建和過程控制優化等方面［9-11］，雖有文獻報道畢赤酵母體系的動力學模型及其參數的估算［12-14］，但是對多拷貝數畢赤酵母動力學模型的研究較少。

因此，本文將以PIP基因拷貝數分別為1、6、12和18的畢赤酵母重組菌為研究對象，通過5L發酵罐進行補料分批培養，建立不同拷貝數畢赤酵母菌體生長、產物生成和底物（甲醇）消耗動力學模型，確定模型參數，并對模型進行驗證和分析。

1　實驗材料和方法

1.1菌株、培養基和種子制備

畢赤酵母GS115菌株，Mut+，載體pAO815、pPIC3.5K，蛋白引導序列來自釀酒酵母的α-雜交因子（α-mating factor， α-MF），外源基因為根據畢赤酵母偏愛密碼子人工合成的PIP基因，分別含目的基因1、6、12和18拷貝的菌株，由本實驗室構建［15］。培養基和種子制備方法按文獻［16］。

1.25L發酵罐發酵方法

從YPD平板上挑單克隆接種至種子搖瓶培養基中， 30℃，220 r·min-1，培養20～24 h，直至OD600達到20左右，按接種量10%接種到裝有2 L分批培養基的5 L發酵罐（上海國強生化工程公司，型號：FUS-5L）中進行培養（用氨水調節pH為5.0）。分批培養至甘油耗盡（20 h左右），此時溶解氧（dissolved oxygen，DO）與pH上升。然后以限制性流速補甘油（500 g·L-1，含12 ml·L-1PTM1）進而提高菌濃。當OD600達到120左右，停止補甘油，饑餓工程菌30 min，一次性加入分析純甲醇使甲醇濃度達到2.5 g·L-1，以使細胞適應甲醇環境，2 h左右DO先下降后上升，再正式進入誘導PIP表達發酵階段，流加100%的甲醇（含12 ml·L-1PTM1），誘導72 h，在誘導過程中通過測定甲醇濃度和DO變化來控制甲醇流加速率。

1.3細胞光密度OD600測定

取樣發酵液稀釋適當倍數后于波長600 nm處，以去離子水為對照進行比色測定，OD600=OD讀數×稀釋倍數。

1.4目的蛋白PIP濃度的測定

采用外標法進行PIP的定量分析。使用Agilent 1100 HPLC系統，色譜柱為ES industries 公司MacroSep C8，5 μm 300?（15 cm×4.60 mm）；流動相：溶液A為20%乙腈，0.1%三氟乙酸；溶液B為90%乙腈，0.1%三氟乙酸；洗脫條件：溶液A 在14 min 內由100%降至70%，溶液B在14 min 內由0增大至30%；流速：1 ml·min-1；柱溫：40℃；檢測波長：214 nm。

1.5甲醇濃度分析

采用GC920氣相色譜儀（上海海欣色譜儀器有限公司）分析發酵液上清中甲醇濃度。填料為Chromosorb101型，色譜柱長1 m，內徑2 mm，載氣為氮氣，流量為15 ml·min-1，空氣和H2的流量分別為300 ml·min-1和30 ml·min-1（10：1），色譜柱溫度為100℃，汽化室和氫火焰溫度為200℃。

2　實驗結果與討論

2.1動力學模型的建立

2.1.1細胞生長動力學模型的建立根據微生物細胞生長特點，細胞生長動力學最常用Monod和Logistic方程描述。

雖然Monod方程模型簡單且有效地描述了菌體的生長，但是其僅僅適應于不存在其他限制性物質的情況下使用，由于本文采用畢赤酵母補料分批培養的過程，達到細胞高密度后發酵液黏稠，為此采用Logistic方程模型來描述菌體生長規律［17］。

Logistic模型是一個典型的S形曲線，能較好反映發酵過程中菌體濃度增加對自身生長帶來的抑制作用。發酵開始時，菌體濃度很低，即X比Xm小得多，X/Xm項可以忽略不計，式（1）表示細胞生長呈對數生長；對數生長期結束后菌體生長處于穩定期，此時X接近于Xm，式（1）表示菌體生長停止。

Logistic方程

2.1.2表達產物PIP生成動力學模型的建立微生物發酵生成的代謝產物非常復雜，涉及到的范圍也比較廣，包括醇類、有機酸、核酸類、抗生素、維生素、氨基酸、酶、生理活性物質等，并且由于細胞內生物合成的途徑十分復雜，其生物合成途徑和代謝調節機制也各具有不同的特點，因此，至今為止還沒有統一的模型可用來描述產物生成動力學。

Gaden［18］根據細胞生長速率與產物生成速率之間的關系，其通用模型可用Leudeking-Piret方程［19］表示

式中，α為與菌體生長相關聯的產物合成常數g·g-1，β為不與菌體生長相關聯的產物合成常數，g·g-1·h-1。當α≠0，β=0時為生長偶聯型；α=0，β≠0時為非生長偶聯型；α≠0，β≠0時為部分生長偶聯型。對于畢赤酵母發酵表達豬胰島素前體（PIP），可以主要分為兩個階段，第1階段為細胞生長階段，這時無產物生成，在此不考慮其模型；第2階段為PIP蛋白表達階段，細胞生長的同時產物也合成，最終細胞生長量趨于穩定，但PIP蛋白繼續合成。根據Jose等［20］報道，畢赤酵母發酵屬于部分生長偶聯型，即α≠0，β≠0。

將式（1）代入式（3）簡化得

積分得

2.1.3底物消耗動力學模型的建立在畢赤酵母發酵過程中，甲醇消耗主要有3個方面生理作用：一是細胞生長的消耗，用以合成新的細胞；二是細胞維持生命活動的消耗；三是生成代謝產物的消耗。甲醇的累計消耗動力學模型可采用以下方程

式中，S為甲醇從開始補料后的累計補料量，g·L-1；YX/S為甲醇用于菌體生長的得率系數，g·g-1；YP/S為甲醇用于產物合成的得率系數，g·g-1；m為維持常數，g·g-1·h-1。

為簡化模型，細胞呼吸等維持代謝消耗的甲醇，可以歸結在細胞生長消耗之內。畢赤酵母發酵的基質消耗大致可分為生長消耗和生成PIP產物消耗兩部分。基質消耗的動力學模型簡化為

式中，k1為細胞生長代謝系數，k2為產物形成代謝系數。

將式（1）、式（4）代入式（7）得

積分得

式（1）、式（3）和式（7）構成畢赤酵母表達PIP發酵過程中細胞生長、PIP表達以及甲醇補料消耗的動力學模型；式（2）、式（5）和式（9）分別為3個模型的積分形式，有助于模型的擬合求解。該模型共6個參數mμ、Xm、α、β、k1、k2描述了發酵過程中細胞生長、PIP表達及甲醇代謝量同發酵時間之間的函數關系。

2.2模型參數求解

根據不同拷貝數的補料分批實驗數據，利用OriginPro8.0軟件對實驗數據進行非線性擬合規劃，采用全局性收斂的修正高斯牛頓法（Levenberg-Marquardt-LM），進而獲得模型參數的最優估計值，結果見表1。

從表1中可以看出不同拷貝數最大比生長速率mμ差異不顯著，且均比整個誘導階段平均比生長速率μ高，這主要是因為誘導前期拷貝數對畢赤酵母細胞的生長影響不大，都能達到較快速度生長，達到相似的最大比生長速率mμ。模型中與菌體生長相關的產物合成系數α均大于與菌體量相關的產物合成系數β，并且隨著拷貝數的增加與菌體生長相關的產物系數α不斷增加，因此，畢赤酵母補料分批發酵中產物生成與菌體生長呈部分偶聯關系，并且與菌體生長偶聯程度較高，高拷貝菌株表達量高于1拷貝菌株其中一個主要原因就是α較高，只有進一步促進高拷貝菌株細胞生長才能更有效地提高PIP的生成速率。從細胞生長代謝系數k1也可以看出，隨著拷貝數的增加k1絕對值不斷增加，這更驗證了高拷貝菌株對生長代謝的要求比較高。

表1　R補料分批發酵動力學參數估計值Table 1　Kinetic parameters estimated for multi-copy P. pastoris cells

圖1　菌體生長的實驗值與模型計算值之間的比較Fig.1　Comparison of experimental data with predicted values of cell growth

非線性規劃得到不同拷貝數菌株的4個動力學模型分別為

1-copy：

6-copy：

12-copy：

圖2　PIP生成的實驗值與模型計算值之間的比較Fig.2　Comparison of experimental data with predicted values of PIP formation

圖3　累計甲醇消耗的實驗值與模型計算值之間的比較Fig.3　Comparison of experimental data with predicted values of total methanol consumption amount

18-copy：

2.3模型的驗證及分析

應用以上求解出來的不同拷貝數動力學模型繪制模型的曲線圖，并將其與甲醇補料發酵的重復實驗值進行比較，結果如圖1～圖3所示。圖中的曲線分別為不同拷貝數菌體生長、產物生產和底物累計消耗的動力學模型擬合曲線。

由圖1～圖3可以看出，不同拷貝數菌株擬合值與實驗值非常接近，大部分擬合情況較好，平均相對偏差均在5%以內，說明所建數學模型較好地反映了多拷貝數畢赤酵母菌株PIP分批補料發酵過程。由于沒有考慮在甲醇補料發酵過程中補料液的流加對發酵液總體積的影響，因此本研究建立的數學模型僅適用于那些發酵液體積變化不大的補料發酵過程。

3　結　論

通過對多拷貝畢赤酵母生產PIP分批補料發酵的發酵動力學研究，采用Origin8.0軟件分析得出了不同外源基因拷貝數菌體細胞生長、產物合成與底物消耗3個動力學模型。根據甲醇補料發酵的特點，建立了發酵過程的菌體生長、產物生成和甲醇累計消耗的動力學模型。結果發現，隨著拷貝數的增加與菌體生長相關的產物系數α和細胞生長代謝系數k1絕對值不斷增加，12拷貝時PIP表達量達到最高，說明只有進一步促進高拷貝菌株細胞生長并減少其代謝負擔才能更有效地提高產物的生成速率。將發酵的實驗值與模型曲線進行比較，發現兩者基本吻合，表明所建立模型能較好地反映PIP分批補料發酵過程。由于沒有考慮在甲醇補料發酵過程中補料液的流加對發酵液總體積的影響，因此本研究建立的數學模型僅適用于那些發酵液體積變化不大的補料發酵過程。

符號說明

k1——細胞生長代謝系數

k2——產物形成代謝系數

m——維持常數，g·g-1·h-1

P——目標產物濃度，g·L-1

S——基質濃度，g·L-1

X，X0，Xm——分別為實際、初始、最大菌體濃度，

g·L-1

YP/S——甲醇用于產物合成的得率系數，g·g-1

YX/S——甲醇用于菌體生長的得率系數，g·g-1

α——與菌體生長相關聯的產物合成常數，

g·g-1

β——不與菌體生長相關聯的產物合成常

數，g·g-1·h-1

μm——最大比生長速率，h-1

References

［1］SHIN C S， HONG M S， BAE C S， et al. Enhanced production of human mini-proinsulin in fed-batch cultures at high cell density of Escherichia coli BL21（DE3）［pET-3aT2M2］ ［J］. Biotechnology Progress， 1997， 13 （3）： 249-257.

［2］THIM L， HANSEN M T， NORRIS K， et al. Secretion and processing of insulin precursors in yeast ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1986， 83 （18）： 6766-6770.

［3］DALY R， HEARN M T. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris： a useful experimental tool in protein engineering and production ［J］. J. Mol. Recognit.， 2005， 18 （2）： 119-138.

［4］CREGG J M. Pichiaprotocols ［M］. Totowa， N.J.： Humana Press，2007：1-10.

［5］AHMAD M， HIRZ M， PICHLER H， et al. Protein expression in Pichia pastoris： recent achievements and perspectives for heterologous protein production ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2014， 98 （12）： 5301-5317.

［6］WANG Y， LIANG Z H， ZHANG Y S， et al. Human insulin from a precursor overexpressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and a simple procedure for purifying the expression product ［J］. Biotechnol. Bioeng.， 2001， 73 （1）： 74-79.

［7］MACAULEY-PATRICK S， FAZENDA M L， MCNEIL B， et al. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system ［J］. Yeast， 2005， 22 （4）： 249-270.

［8］郭美錦， 朱泰承， 張明，等.重組畢赤酵母甲醇利用表型與基因拷貝數對外源基因表達的影響 ［J］. 中國生物工程雜志， 2007， 27（7）： 7-11 GUO M J， ZHU T C， ZHANG M， et al. Influences of methanol utilization phenotype and gene dosage on heterologous protein expression in recombinant Pichia pastoris ［J］. China Biotechnology，2007， 27 （7）： 7-11.

［9］王燕， 梁鎮和， 馮佑民，等. 人胰島素在甲醇酵母Pichia pastoris中的分泌表達 ［J］. 生物化學與生物物理學報，1999， 31 （5）：587-589. WANG Y， LIANG Z H， FENG Y M， et al. Secretory expression of human insulin in Methylotrophic yeast Pichia pastoris ［J］. Acta Biochimica et Biophysica Sinica， 1999， 31 （5）： 587-589.

［10］姚鈺舜， 儲炬， 杭海峰， 等. 培養條件對重組畢赤酵母高密度表達豬胰島素前體的影響 ［J］. 華東理工大學學報，2006， 32 （4）：397-401. YAO Y X， CHU J， HANG H F， et al. Culture conditions affecting high level expression of Porcine Insulin Precursor（PIP）by recombinant Pichia pastoris in high cell density fermentation ［J］. Journal of East China University of Science and Technology， 2006， 32 （4）：397-401.

［11］ZHU T C， HANG H F， CHU J， et al. Transcriptional investigation of the effect of mixed feeding to identify the main cellular stresses on recombinant Pichia pastoris ［J］. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology， 2013， 40 （2）： 183-189.

［12］陳文， 郭美錦， 儲炬， 等.重組畢赤酵母表達豬胰島素前體代謝參數分析和動力學模型 ［J］. 華東理工大學學報， 2005， 31 （3）：300-304. CHEN W， GUO M J， CHU J， et al. Metabolic data association analysis and modeling for recombinant Porcine Insulin Precursor expression in genetically engineered Pichia pastoris ［J］. East China University of Science and Technology， 2005， 31 （3）： 300-304.

［13］HANG H F， CHEN W， GUO M J， et al. A simple unstructured model-based control for efficient expression of recombinant porcine insulin precursor by Pichia pastoris ［J］. Korean J. Chem. Eng.， 2008， 25 （5）： 1065-1069.

［14］MENDOZA MUNOZ D F， ALGECIRA ENCISO N A， CORDOBA RUIZ H， et al. A simple structured model for recombinant IDShr protein production in Pichia pastoris ［J］. Biotechnol. Lett.， 2008，30 （10）： 1727-1734.

［15］ZHU T C， GUO M J， TANG Z Y， et al. Efficient generation of multi-copy strains for optimizing secretory expression of porcine insulin precursor in yeast Pichia pastoris ［J］. Journal of Applied Microbiology， 2009， 107 （3）： 954-963.

［16］郭美錦， 吳康華， 杭海峰， 等. 基因工程菌Pichia pastoris高密度培養條件研究 ［J］. 微生物學通報， 2001， 28 （3）： 6-11. GUO M J， WU K H， HANG H F， et al. Studies on conditions of cell high density cultivation for genetically engineered methylotrophic Pichia pastoris ［J］. Microbiology， 2001， 28 （3）： 6-11.

［17］豐強強， 潘玉霖， 成寶琨， 等. 2-KGA混菌發酵大小菌耦合關系研究及建模 ［J］.化工學報， 2013， 64 （7）： 2520-2525. FENG Q Q， PAN Y L，CHENG B K， et al. Modeling on interaction of different strains in 2-KGA mixed culture fermentation ［J］. CIESC Journal， 2013， 64 （7）： 2520-2525.

［18］GADEN E L. Fermentation process kinetics ［J］. J. Biochem. Microhiol. Technol.， 1959， 1 （4）： 413-429.

［19］ZHANG W H， HYWOOD POTTER K J， PLANTZ B A， et al. Pichia pastoris fermentation with mixed-feeds of glycerol and methanol：growth kinetics and production improvement ［J］. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.， 2003， 30 （4）： 210-215.

［20］PAIS J M， VARAS L， VALDS J， et al. Modeling of mini-proinsulin production in Pichia pastoris using the AOX promoter ［J］. Biotechnol. Lett.， 2003， 25 （3）： 251-255.

Kinetic modelling of porcine insulin precursor （PIP） expressed by multi-copy recombinant Pichia pastoris

CHEN Li1，2， WANG Yue2， GUO Meijin2， CHU Ju2， ZHUANG Yingping2
（1National Research Center of Engineering and Technology for Veterinary Biologicals， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014， Jiangsu， China；2Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing Technology， East China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China）

Kinetic modelling of recombinant Pichia pastoris harboring multiple porcine insulin precursor （PIP）gene dosages was studied when the cells were grown in the fed-batch culture. The key parameters of this kinetics were estimated， including specific cell growth rate （h-1）， PIP production rate （g·g-1·h-1） and substrate consumption rate （g·g-1·h-1） with nonlinear curve fit by Origin8.0. The results showed that both growth-associated production coefficient （α） and growth-associated metabolism coefficient （k1） increased with increasing copy numbers. The expression level of PIP reached the highest at the copy number of 12. These results suggested that rapid growth and lower metabolic burden of a high copy number effectively improved the production rate of target proteins. Furthermore， the predicted values based on the established kinetic model were in good agreement with the experimental data， indicating that the kinetic model could be used to describe recombinant PIP production process in fed-batch fermentation mode.

date： 2015-09-10.

Prof. GUO Meijin， guo_mj@ecust.edu.cn

supported by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest（201303046）， the National High Technology Research and Development Program of China （2012AA021201）， and the Open Project Program of State Key Laboratory of Bioreactor Engineering（2060204）.

recombinant Pichia pastoris； porcine insulin precursor expression； gene dosage； kinetic model

TQ 464.7

A

0438—1157（2016）05—2015—07

2015-09-10收到初稿，2015-11-19收到修改稿。

聯系人：郭美錦。第一作者：陳麗（1979—），女，碩士，助理研究員。

農業公益性行業科研專項經費項目（201303046）；國家高技術研究發展計劃重點項目（2012AA021201）；生物反應器工程國重室開放課題資助（2060204）。