新疆沙棗多糖的提取分離及抗氧化活性研究

陳晴晴，楊金鳳，劉紅（．石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)理學(xué)院，新疆石河子832000）

新疆沙棗多糖的提取分離及抗氧化活性研究

陳晴晴1，楊金鳳1，劉紅2，*
（1．石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)理學(xué)院，新疆石河子832000）

采用水提醇沉法提取新疆沙棗多糖，并采用DM-18型大孔樹脂對粗沙棗多糖進行分離純化，確定了最佳的分離條件。通過粗沙棗多糖和純化后的沙棗多糖對DPPH自由基、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2－·）的清除能力進行比較。結(jié)果表明：在沙棗多糖樣品溶液2.0 mg/mL，上樣速率為1.5 BV/h，上樣液pH值為7.0，上樣量為3.0 BV、洗脫劑乙醇濃度為35%、洗脫劑用量為3.0 BV、洗脫速率為1.0 BV/h時，洗脫劑pH值為8時，DM-18型大孔樹脂對沙棗多糖的動態(tài)吸附率和解吸率分別達到90.23%和92.37%，粗沙棗多糖的純度為42.33%，純化后的多糖純度為70.56%。粗多糖和純化后多糖對DPPH·、·OH、O2－·均有清除作用，純化后多糖的抗氧化活性大于粗多糖。

沙棗多糖；大孔樹脂；分離；純化；抗氧化

多糖類物質(zhì)在自然界中廣泛分布于動物、植物及微生物中，是一類具有復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)和特定生物活性的有機大分子化合物[1]。如今多糖類化合物廣泛的被應(yīng)用在醫(yī)療、保健等方面，多糖作為中藥的主要有效成分，其研究發(fā)展速度很快，已有數(shù)種多糖被作為廣譜免疫促進劑應(yīng)用于臨床治療中[2-3]。沙棗具有抗旱、抗鹽堿的特性，在新疆有豐富的資源，且具有很高的食用與藥用價值，沙棗能“強壯，鎮(zhèn)靜，固精，健胃，止瀉，調(diào)經(jīng)，利尿”，因而作為維吾爾族人民在民間長期食用[4]。沙棗中多糖含量在9%～10.9%之間，平均含量9.76%[5-6]。以DM-18型大孔吸附樹脂為分離純化沙棗多糖的材料，確定其最佳吸附及解吸條件，并對粗沙棗多糖和純化多糖兩者的抗氧化活性能力進行比較，為沙棗多糖的進一步開發(fā)及應(yīng)用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

沙棗：采自石河子地區(qū)；DM-18型大孔樹脂：山東魯抗立科藥物化學(xué)限公司；DPPH：美國Sigma公司生產(chǎn)；鄰苯三酚、95%乙醇、水楊酸、濃硫酸、苯酚、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、氫氧化鈉、鹽酸：均為分析純；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：購自北京中國藥品生物制品鑒定所。

層析柱：購自中國科學(xué)院昆明植化所；飛鴿牌臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；BüchiRotavapor旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：瑞士BüchiLabotechnikAG；722G可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；BS210電子分析天平：德國Sartorius公司。

1.2方法

1.2.1沙棗多糖含量的測定

沙棗多糖含量采用硫酸－苯酚法，以葡萄糖為對照品，用可見分光光度法在波長490 nm處測定其吸光度，得回歸方程A=0.010 1c+0.002 7，R=0.999 1；通過測定樣品溶液的吸光度計算溶液中多糖的含量。

1.2.2沙棗多糖的提取

沙棗粉碎后過30目篩，稱取1.00 kg，用95%乙醇浸泡24 h除去脂溶性成分，然后過濾，濾渣按質(zhì)量比1∶14的量加熱水，熱水浸提2次，90 min/次，溫度90℃；抽濾，合并濾液，離心；取上清液旋蒸，濃縮至一定體積后再離心；加入95%的乙醇，冷藏醇沉24 h，依次醇沉2次，過濾得沉淀，至通風(fēng)處晾干后，將沉淀物加水復(fù)溶，用sevage法除蛋白2次～3次，透析48 h，濃縮，冷凍干燥即得沙棗多糖粗品，根據(jù)1.2.1方法對粗沙棗多糖的純度進行測定，結(jié)果為42.33%。

1.2.3大孔樹脂柱層析分離

沙棗多糖的初級分離采用大孔樹脂法，前期試驗優(yōu)選出DM-18型大孔樹脂為分離沙棗多糖的分離材料。通過該大孔樹脂對多糖的吸附和解吸正交試驗，確定出該大孔樹脂對沙棗多糖的最佳分離條件，在最佳分離條件下，依次上樣吸附和解吸，得到的解吸液旋蒸濃縮，冷凍干燥，既得DM-18型大孔樹脂純化后的沙棗多糖樣品，根據(jù)1.2.1方法對粗沙棗多糖的純度進行測定，純化多糖的純度為70.56%。

1.2.3.1大孔樹脂的吸附試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取沙棗多糖上樣液濃度1.5、2.0、2.5 mg/mL；上樣量2.0、3.0、4.0 BV；上樣速率1.0、1.5、2.0 BV/h；上樣液pH 7.0、8.0、9.0，進行正交試驗，以DM-18大孔樹脂對沙棗多糖的吸附率為評價指標(biāo)，設(shè)計L9（34）正交試驗。

1.2.3.2大孔樹脂的解吸試驗

第三層，“時為岑寂也，若游峨眉之雪；時為流逝也，若在洞庭之波”。遠(yuǎn)的第三層次就是一種自然山水之境。而自然山水之境是中國古典藝術(shù)意境的最高境界。從莊子的游心于“物之初”到魏晉名士的恣情于丘壑之間，再到宋元文人的水墨山水情趣，自然山水一直是文人墨客筆下的心頭愛。而在琴者彈琴中，所要創(chuàng)造的最高意境也就是自然山水之境。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取洗脫劑乙醇濃度選取25%、35%、45%；洗脫劑乙醇用量選取2.0、3.0、4.0 BV；洗脫速率選取1.0、2.0、3.0 BV/h，洗脫劑pH 6.0、7.0、8.0，進行正交試驗，以DM-18大孔樹脂對沙棗多糖的解吸率為評價指標(biāo)，設(shè)計L9（34）正交試驗。

1.2.4沙棗多糖的抗氧化活性試驗

由1.2.1得到的沙棗多糖粗品，和經(jīng)DM-18型大孔樹脂分離后的純化沙棗多糖，配成一定濃度的沙棗多糖溶液，分別進行以下三方面的抗氧化活性試驗，并對兩者的抗氧化能力進行比較。

1.2.4.1清除DPPH·的能力

分別取未純化的粗沙棗多糖和用大孔樹脂純化后的多糖進行試驗，取不同濃度的樣品溶液2.0 mL和0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2.0 mL，加入具塞試管中混勻，室溫避光反應(yīng)30min，在517 nm下測吸光度值A(chǔ)i[7]，2.0 mL DPPH溶液加2.0 mL蒸餾水的吸光度值為A0，2.0 mL無水乙醇加2.0 mL樣品溶液吸光度值為Aj，以等體積的蒸餾水和無水乙醇混合為空白。清除率/%=[A0－（Ai－Aj）]/A0×100。

1.2.4.2清除羥基自由基（·OH）的能力

·OH是最活潑的活性氧自由基，也是危害最大的氧自由基，采用Fenton反應(yīng)[8]，分別取未純化的粗沙棗多糖和用大孔樹脂純化后的多糖進行試驗，在試管中分別加入1.0 mL各濃度的樣品溶液，1.0 mL 6 mmol/L FeSO4，1.0 mL 6 mmol/L水楊酸乙醇溶液，1.0 mL 6 mmol/L H2O2，混勻，在37℃水浴中加熱30 min，在波長510 nm下測吸光度值A(chǔ)i，再將體系中樣品溶液用1.0 mL蒸餾水代替，測得吸光度值為A0，將體系中H2O2用蒸餾水代替，測得吸光度值為Aj。清除率/%=[A0－（Ai－Aj）]/A0× 100。

1.2.4.3清除超氧陰離子（O2－·）的能力

2　結(jié)果與分析

2.1DM-18型大孔樹脂對沙棗多糖動態(tài)吸附的正交試驗

以大孔樹脂對沙棗多糖的吸附率為考察指標(biāo)，設(shè)計L9（34）正交試驗，試驗結(jié)果見表1。

如表1所示，DM-18型大孔樹脂對沙棗多糖的最佳吸附條件為A2B2C1D2，即上樣濃度為2.0 mg/mL，上樣速率為1.5 BV/h，上樣液pH值為7.0，上樣量為

表1　正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 1　The orthogonalexperimentaldesign and the analysis of the result

3.0BV。極差分析結(jié)果表明，對樹脂吸附效果影響程度大小依次為：B＞A＞C>D。在最佳試驗條件下進行驗證試驗，平行3組試驗，平均吸附率為90.23%，大于正交組任一組數(shù)據(jù)，正交試驗數(shù)據(jù)真實可行。

2.2DM-18型大孔樹脂對沙棗多糖解吸的正交試驗在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以大孔樹脂對沙棗多糖的解吸率為考察指標(biāo)，設(shè)計L9（33）正交試驗，試驗結(jié)果見表2。

表2　正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 2　The orthogonalexperimentaldesign and the analysis of the result

從表2可知，DM-18型大孔樹脂對沙棗多糖的最佳解吸條件為A2B1C3D2，即洗脫劑乙醇濃度為35%、洗脫速率為1.0 BV/h、洗脫劑pH值為8，洗脫劑用量為3.0 BV。極差分析結(jié)果表明，對樹脂解吸效果影響程度大小依次為：A＞D＞B＞C。在最佳試驗條件下進行驗證試驗，平行3組試驗，平均解吸率為92.37%，大于正交組任一組數(shù)據(jù)，正交試驗數(shù)據(jù)真實可行。

2.3沙棗多糖的抗氧化活性分析

2.3.1清除DPPH·的能力分析

以粗沙棗多糖和純化后的沙棗多糖對DPPH·的清除能力比較，設(shè)計對比試驗，試驗結(jié)果見表3。

表3　沙棗多糖清除DPPH·能力比較Table 3　Effectof Elaeagnus polysaccharides on DPPH·

由表3可知，隨著質(zhì)量濃度的增大，沙棗多糖對DPPH·的清除能力增加，純化多糖對DPPH·的清除率明顯比粗多糖的高，說明純化多糖能更有效的清除DPPH·。

2.3.2清除羥基自由基（·OH）的能力分析

以粗沙棗多糖和純化后的沙棗多糖對·OH的清除能力比較，設(shè)計對比試驗，試驗結(jié)果見表4。

表4　沙棗多糖清除羥基自由基（·OH）的能力比較Table 4　Effect of Elaeagnus polysaccharides on·OH

·OH是最活潑的活性氧自由基，也是危害最大的氧自由基，它幾乎能與活細(xì)胞中任何分子發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)速度極快。由表4可知，隨著多糖濃度的增加，對·OH的清除作用明顯增加，其中多糖的活性順序為純化多糖＞粗多糖。結(jié)果表明，純化多糖能更有效的清除·OH。

2.3.3清除超氧陰離子（O2－·）的能力分析

以粗沙棗分糖和純化后的沙棗多糖對O2-·的清除率能力比較，設(shè)計對比試驗，試驗結(jié)果見表5。

表5　沙棗多糖清除超氧陰離子（O2－·）的能力比較Table 5　Effectof Elaeagnus polysaccharides on O2－·

由表5可知，隨著多糖濃度的不斷增大，沙棗多糖對O2－·的清除能力增大，其中多糖的活性順序為純化多糖＞粗多糖。當(dāng)多糖濃度小于1.0 mg/mL時，兩種多糖對O2－·的清除能力相差不大，之后差異性增大，結(jié)果表明，純化多糖能更有效的清除O2－·。

3　結(jié)論

采用水提醇沉法，從新疆沙棗中提取多糖類物質(zhì)，得到純度為42.33%的沙棗多糖粗品，通過DM-18型大孔樹脂對沙棗多糖進行分離純化，由動態(tài)吸附及解吸試驗可知，通過正交試驗得到最佳的吸附及解吸條件，在最佳條件下，DM-18型大孔樹脂對沙棗多糖的吸附率達90.23%，解吸率達92.37%，并在該最佳條件下，得到DM-18型大孔樹脂純化后的沙棗多糖，其純度為70.56%，通過大孔樹脂的的分離純化，沙棗多糖的純度明顯提高。

沙棗粗多糖和經(jīng)DM-18型大孔樹脂純化后的多糖對DPPH·、·OH、O2－·均有清除作用，且隨著多糖濃度的增大，對自由基的清除作用增加，而經(jīng)DM-18型大孔樹脂純化后的多糖比粗多糖有更明顯的清除效果，純化沙棗多糖抗氧化活性明顯優(yōu)于粗多糖，沙棗多糖對3種自由基的清除能力由強到弱總體趨勢是：DPPH·＞O2－·＞·OH。

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Purification and Antioxidant Activity of Polysaccharide from Elaeagnus angustifolia in Xinjiang

CHEN Qing-qing1，YANG Jin-feng1，LIU Hong2，*
（1.College ofChemistry and Chemical Engineering，Shihezi University，Shihezi832000，Xinjiang，China；2.College of Science，Shihezi University，Shihezi832000，Xinjiang，China）

Polysaccharide from Elaeagnus angustifolia in Xinjiang was extracted by water-alcohol precipitation. DM-18 macroporous resins were used to isolate the crude polysaccharide，the best condition was confirmed. Antioxidant activities of the crude and purified polysaccha ride were evaluated through their capability of scavenging DPPH·，·OH，O2－·.The result showed that best conditions as follows：2.0 mg/mL of concentration and 7.0 of pH of the solution of Elaeagnus angustifolia polysaccharide，the sample loading amount of 3.0 BV，1.5 BV/h ofthe rate，the eluent concentration of35%，the total quantity of eluentof 3.0 BV，8 ofpH ofthe solution and eluent rate of 1.0 BV/h.The rates of absorption and desorption could achieve 90.23% and 92.37% under the conditions above.The purity of the crude polys accharide and the purified polysac charide were 42.33%and 70.56%.Both ofthe polysaccharide crude and purified had significanteffecton scavenging DPPH·，·OH，O2－·. Further more purified polysac charide had more activity antioxidant than crude polysac charide.

Elaeagnus angustifolia polysac charide；macroporous resins；separate；purificate；antioxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.009

教育部國際合作項目“春暉計劃”（Z2006－1－83003）

陳晴晴（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。

劉紅，女（漢），教授，碩士生導(dǎo)師,研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

2013-09-28