石榴皮總多酚的微波輔助提取工藝及抗氧化活性研究

黃琦，王啟越，李穎，葉春林（.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江杭州30023；2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州30023）

石榴皮總多酚的微波輔助提取工藝及抗氧化活性研究

黃琦1，2，王啟越1，李穎1，葉春林1，2
（1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江杭州310023；2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州310023）

利用響應面分析法優化石榴皮總多酚的微波輔助提取工藝，以總多酚得率為指標，通過單因素試驗及響應面分析，研究了乙醇體積分數、提取時間、提取功率和液固比4個主要因素對石榴皮總多酚得率的影響。采用Box-Benhnken中心組合設計和響應面分析法，建立了回歸方程的預測模型，確定最佳提取條件為乙醇體積分數58%、提取時間98 s、提取功率235 W、液固比49∶1（mL/g）。此條件下總多酚得率為（23.26±0.15）%。試驗結果與模型預測值基本相符。用紅外光譜對總多酚提取物進行了表征。石榴皮總多酚對DPPH自由基的半清除質量濃度為0.28 mg/mL，具有較強的抗氧化作用。

石榴皮；總多酚；響應面分析法；微波輔助提取；抗氧化活性

石榴皮是《中國藥典》收載的一種中草藥[1]，Saito 等[2]研究發現石榴皮提取物的抗氧化能力在日本上千種藥用植物中位列第一，且其抗氧化活性與多酚含量相關。石榴皮總多酚不僅具有較強的抗氧化性，還有抗菌、消炎、驅蟲、澀腸、止血等功效，具有廣闊的開發價值和應用前景。石榴皮總多酚大多以苯環的多羥基取代為特征，主要包括黃酮類、鞣質類和有機酸類化合物[3-4]。本研究利用響應面法對微波輔助提取石榴皮中總多酚的工藝進行優化，先采用單因素試驗分析乙醇體積分數、提取時間、液固比和提取功率對總多酚得率的影響，再通過響應面優化得出最佳提取條件，并對提取的總多酚進行紅外光譜結構表征。通過石榴皮總多酚對DPPH自由基的清除作用測定其抗氧化活性，以期為石榴皮的深入開發與應用提供試驗和理論依據。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

陜西石榴皮葉烘干、粉碎，過60目篩，置陰涼干燥處備用。DPPH自由基、維生素C（VC）：美國sigma公司；福林酚試劑：北京奧博星生物技術有限責任公司；沒食子酸（分析純）、無水乙醇（分析純）、碳酸鈉（分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水為蒸餾水。

1.2主要儀器設備

WGD2S.01型微波設備：南京三樂微波技術發展有限公司；DFY-500搖擺式高速中藥粉碎機：溫嶺市大德中藥器械有限公司；低速離心機：江蘇天力醫療器械有限公司；752紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；BSA224S萬分之一電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；DKS-24型電熱恒溫水浴鍋：杭州藍天化驗儀器廠。

1.3方法

1.3.1標準曲線的繪制

精密稱取10 mg已干燥至恒重的沒食子酸標準品，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得100μg/mL的沒食子酸標準溶液，備用。分別精確量取沒食子酸標準品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分別置于25 mL的具塞容量瓶中，采用福林法參照文獻[5]方法測定吸光度，以吸光度A為縱坐標、沒食子酸的濃度C（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.2石榴皮總多酚的提取和測定

準確稱取0.4 g石榴皮粉末，加一定體積的乙醇-水溶液，在特定的微波功率下提取，然后迅速冷卻，4 000 r/min離心15 min，殘渣按上述條件重復提取1次，合并上清液，用提取溶劑定容至50 mL。

1.3.3石榴皮總多酚得率

準確移取待測液0.1mL，置于25 mL的具塞試管中，參照1.3.1方法測定總多酚吸光度，代入回歸方程，按沒食子酸當量計算總多酚含量。總多酚得率/%=提取液中總多酚質量/原料質量×100。

1.3.4單因素試驗

石榴皮粉末過60目篩后，考察乙醇體積分數、提取時間、液固比和提取功率對總多酚得率的影響。

1.3.5響應面優化分析石榴皮總多酚提取工藝

采用Design-Expert8.0.6軟件處理數據，根據單因素試驗結果，以總多酚得率為響應值，設計四因素三水平的響應面分析試驗。

1.3.6石榴皮中總多酚的紅外光譜表征

上述總多酚提取物烘干、KBr壓片，在波數400 cm-1～4 000 cm-1處掃描。

1.3.7對DPPH自由基的清除作用

參考Ye等[6]的方法測定，以VC為參比，測定石榴皮總多酚提取物對DPPH自由基的清除作用。

2　結果與分析

2.1標準曲線的繪制

按1.3.1方法得到總多酚標準曲線的線性回歸方程為：A=0.110 7C+0.009 1，相關系數r=0.999 2。

2.2單因素試驗

隨著我國社會經濟的不斷發展，道路交通建設實現了高速發展，同時隨著人們生活水平和人均收入的不斷提高，購買私家車的家庭也逐年增多。私家車數量上的增多一方面給人們的生活帶來了極大的便利，另一方面增加了城市交通管理的復雜性，交通事故出現的概率較往年而言也有了大幅度的增加，其中酒駕事故的頻頻發生，不僅給自身而且也給社會安全帶來了極大危險，由此，人們對于該方面的立法也給予了足夠的關注和認識。

2.2.1乙醇體積分數對總多酚得率的影響

在提取時間60 s，液固比30∶1（mL/g），微波功率200 W條件下，用不同體積分數的乙醇（30%、40%、50%、60%、70%）提取石榴皮總多酚，結果見圖1。

圖1　乙醇體積分數對總多酚得率的影響Fig.1　Effects ofethanolconcentration on extraction yield of total polyphenols

從圖1可知，乙醇體積分數對石榴皮總多酚得率有較大影響，當乙醇體積分數達到60%時，總多酚得率最高，隨后有所下降。根據相似相溶原理，可能是總多酚極性與60%的乙醇溶液的極性相似。另外，乙醇體積分數過高，脂溶性物質溶出也增加，干擾因素也隨之增大。

2.2.2微波提取時間對總多酚得率的影響

在液固比30∶1（mL/g），微波功率200 W，乙醇體積分數的60%的條件下，改變提取時間（30、60、90、120、150 s）提取石榴皮總多酚，結果見圖2。

圖2　提取時間對總多酚得率的影響Fig.2　Effects ofextraction time on extraction yield of total polyphenols

從圖2可知，提取時間對總多酚得率的影響呈先上升后下降的趨勢，90 s附近時總多酚得率達到最大。當提取時間較短時，石榴皮總多酚浸出太少；提取時間過長時，可能是由于溫度的升高導致總多酚不穩定而被破壞分解，從而使得率略有下降趨勢。

2.2.3微波提取功率對總多酚得率的影響

在液固比30∶1（mL/g），乙醇體積分數的60%，提取時間60 s的條件下，改變微波提取功率（100、200、300、400、500、600 W）提取石榴皮總多酚，結果見圖3。

圖3　提取功率對總多酚得率的影響Fig.3　Effects ofe the microwave power on extraction yield of total polyphenols

2.2.4液固比對總多酚得率的影響

在乙醇體積分數的60%，提取時間60s，微波提取功率200W的條件下，改變液固比 [10∶1、20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1（mL/g）]提取石榴皮總多酚，結果見圖4。

圖4　液固比對得率的影響Fig.4　Effects of liquid-solid ratio on extraction yield of total polyphenols

從圖4可知，液固比對石榴皮總多酚的提取得率有影響，提取得率隨液固比增加而增大，其中30∶1（mL/g）之后的增長率變得緩慢。濃度差所產生的滲透壓力是植物細胞組織與提取溶劑之間相平衡過程的主要推動力，而液固比反映了濃度差，濃度差越大，擴散推動力就越大，從而有利于提高浸取效率。但是過高的液固比，并不會明顯提高提取效果，并且會消耗大量的溶劑。

2.3石榴皮總多酚提取的響應面優化分析

2.3.1模型的建立及顯著性檢驗

根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計，以總多酚得率為目標函數，綜合2.2單因素試驗結果，選取乙醇體積分數（A）、微波提取時間（B）、微波提取功率（C）和液固比（D）為試驗因素，設計四因素三水平的響應面分析試驗。響應面因素水平見表1，設計方案與結果見表2，回歸二次方程的方差顯著性檢驗分析結果見表3。

表1　響應面試驗設計因素和水平Table 1　Experimentalfactors and levels in response surface design

表2　響應面試驗設計與結果Table 2　Arrangement and experimentalresults ofresponse surface design

表3　響應面分析法對總多酚得率的方差分析Table 3　Analysis ofvariance ofthe constructed regression model

采用Design-Expert8.0.6軟件對試驗結果建立二次響應面回歸模型，以石榴皮總多酚得率為響應值的回歸方程為：得率＝-11.505 08＋0.712 75A＋0.089 494B+ 0.057 090C+0.100 70D－2.083 33×10-4AB－5.8×10-4AC＋2.45×10-3AD＋8×10-5BC＋1.4×10-3BD－3.375×10-4CD－5.860 83×10-3A2－8.456 48×10-4B2－3.085 83×10-5C2－2.785 83×10-3D2。

由表3可知，以石榴皮中總多酚得率為響應值時，回歸方程顯著性檢驗P<0.000 1，表明該二次方程模型極顯著；同時，失擬項P=0.142 5>0.100 0，不顯著，表明試驗結果和數學模型擬合度良好，即可用該數學模型推測試驗結果[7]。模型的R2=0.946 1，說明響應值的94.61%是由于所選變量引起，表明該方程具有較好的擬合相關性，可以用該回歸方程確定最佳提取工藝[8-9]。另外，所建模型的變異系數（C.V.）為0.99%，表明模型重復性良好[10]。通過模型的回歸方差分析（表3）可以看出，4個因素對得率的影響都是極顯著的（P<0.01），交互相AC、BD、CD對試驗結果的影響也是極顯著的（P< 0.01），交互相AD、BC（P<0.05）對試驗結果影響顯著。

2.3.2提取工藝的響應面交互作用分析與優化

各因素之間的交互作用繪制響應面曲線圖，見圖5～圖10。

圖5　乙醇體積分數和提取時間對總多酚得率的響應面和等高線Fig.5　Response surface and contour line of ethanolconcentration and extraction time

圖6　乙醇體積分數和提取功率對總多酚得率的響應面和等高線Fig.6　Response surface and contour line of ethanolconcentration and extraction power

圖7　乙醇體積分數和液固比對總多酚得率的響應面和等高線Fig.7　Response surface and contour line of ethanolconcentration and liquid-solid ratio

圖8　提取時間和提取功率對總多酚得率的響應面和等高線Fig.8　Response surface and contour line ofextraction time and extraction power

圖9　提取時間和液固比對總多酚得率的響應面和等高線Fig.9　Response surface and contour line ofextraction time and liquid-solid ratio

圖10　提取功率和液固比對總多酚得率的響應面和等高線Fig.10　Response surface and contour line ofextraction power and liquid-solid ratio

等高線圖可反映出2個變量間交互作用的顯著程度，等高線圖的圓心越接近橢圓表示交互作用越強，等高線的稀疏表示響應面圖形的平陡[11]。由圖5可見，乙醇體積分數和提取時間等高線圖的圓心趨于圓形，兩因素交互作用不顯著，而圖6～圖10所示的兩因素交互作用較顯著。由圖5～圖7可見，總多酚得率隨乙醇體積分數增大而升高，但升高到一定程度以后，略有下降，根據相似相溶的原理，最佳的乙醇濃度是由石榴皮總多酚的極性決定的。由圖5、圖8和圖9可見，總多酚得率隨著提取時間的增大先增大后減小，根據提取動力學理論，提取時間的延長有助于總多酚的充分擴散析出，但過長的提取時間會加劇總多酚在較高溫度環境中的破壞，從而影響了總多酚的得率。由圖6、圖8和圖10可見，總多酚得率隨著提取功率的增大而增加，但升高到一定程度以后，趨于平緩，因為提取功率增大使得溫度升高，提取的總多酚增多的同時使得一部分對熱不穩定的成分被破壞，從而影響了得率。由圖7、圖9和圖10可見，總多酚得率隨液固比的增大先增大，后趨于平穩略有減小。

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，在選取的4個因素試驗水平范圍內，得出石榴皮總多酚的理論最佳微波輔助提取工藝條件為：乙醇體積分數58%、提取時間98 s、提取功率235 W、液固比49∶1（mL/g）。在此提取工藝條件下連續進行3次石榴皮總多酚的提取試驗，測得平均得率為（23.26±0.15）%，與預測得率23.30%接近，說明該模型與實際情況擬合性良好。

2.4紅外光譜分析

提取物紅外光譜掃描見圖11。

圖11　總多酚樣品的紅外光譜圖Fig.11　IR spectrogram for sample

由圖11可知，3 368.07 cm-1處有強寬的吸收峰對應O-H伸縮振動；1 702.82、1621.44 cm-1對應羰基吸收峰，1 521.05、1 483.97 cm-1處的吸收峰對應芳環上的骨架振動；1 406.08、1 334.42 cm-1處的吸收峰對應次甲基面內彎曲振動，1 300 cm-1～1 000 cm-1有C-O的伸縮振動峰，900 cm-1～650 cm-1有多個吸收峰，說明苯環上有多個取代結構。紅外光譜特征和文獻[12]報道多酚類化合物紅外光譜特征一致，可確認化學組成為多酚類物質。

2.5對DPPH自由基的清除作用測定

石榴皮總多酚提取物和VC對DPPH自由基清除作用見圖12。

由圖12可見，隨著石榴皮總多酚提取物的濃度增加，對DPPH自由基清除能力也增大。總多酚提取物和VC的半清除質量濃度（IC50）分別為0.28 mg/mL 和0.26 mg/mL，兩者對DPPH自由基清除能力相近。

3　結論

微波輔助提取石榴皮總多酚的最佳提取工藝：以石榴皮粉末為原料，乙醇體積分數58%、提取時間98 s、提取功率235 W、液固比49∶1（mL/g）。此條件下的平均得率為（23.26±0.15）%，與預測值相符，可用于微波輔助提取石榴皮總多酚得率的預測和分析。利用紅外光譜對石榴皮總多酚進行結構表征，符合多酚類化合物紅外光譜特征。提取物對DPPH自由基清除作用的IC50為0.28 mg/mL，說明石榴皮總多酚具有較強的抗氧化能力。石榴皮總多酚的深入開發和利用有待進一步研究。

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Study on Microwave Assisted Extraction and Antioxidant Activity of Total Polyphenols from Pomegranate Rind

HUANG Qi1，2，WANG Qi-yue1，LIYing1，YE Chun-lin1，2
（1.School of Biologicaland Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemicaland Biological Processing Technology ofFarm Products，Hangzhou 310023，Zhejiang，China）

Response surface method was used to optimize the technologicalconditions ofmicrowave assisted extracting total polyphenols from pomegranate rind.Extraction yield of polyphenols as an indicator，single factorexperiment and response surface method were used to discuss the influence on extraction yield by the ethanol concentration，extraction time，the microwave power and liquid-solid ratio.The regression equation prediction model was developed by Box-Benhnken center combination design and response surface method.The optimal extract conditions were as follows：ethanol concentration 58%，extracting time 98 s，the microwave power 235 W，liquid-solid ratio 49∶1（mL/g）.Under the condition，the extraction yield of polyphenols was（23.26± 0.15）%.The obtained polyphenols was characterized by IR spectra.The IC50values ofthe obtained extracts against DPPH free radicals was 0.28 mg/mL，suggesting that polyphenols from pomegranate rind had a remarkable antioxidanteffect.

pomegranate rind；totalpolyphenols；response surface method；microwave assisted extraction；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.011

國家級大學生創新訓練計劃項目（201511057011）；浙江省高等學校國內訪問學者專業發展項目（2015-58）

黃琦（1980—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品、藥品質量安全與控制。

2015-06-09