葛根超微粉總黃酮的雙頻超聲輔助提取與純化

楊麗維，陳穎，張峻（天津市林業果樹研究所，天津300384）

葛根超微粉總黃酮的雙頻超聲輔助提取與純化

楊麗維，陳穎，張峻
（天津市林業果樹研究所，天津300384）

以葛根超微粉為原料，采用雙頻超聲強化法進行葛根黃酮的提取，利用大孔樹脂吸附法進行純化，并采用HPLC法進行葛根素的含量測定。結果表明，雙頻超聲輔助提取中總黃酮含量為275.16 mg/g，明顯高于單頻超聲輔助提取的190.8 mg/g，說明雙頻超聲技術與超微粉碎技術相結合可以促進有效成分的提取。葛根素含量由純化前的11.15%提高到82.47%，純化效果較好。

葛根；超微粉；黃酮；雙頻超聲輔助提取；純化

葛根為豆科植物野葛和粉葛的干燥塊根。葛根除了含有很高的淀粉成分外，還含有黃酮類物質和異黃酮類化合物，其中主要有效成分為葛根素，具有提高免疫、增強心肌收縮力、保護心肌細胞、降低血壓、抗血小板聚集等作用。

近年來，人們用超聲波輔助提取葛根中的有效成分頗有成效，但是其聲場不夠均勻，較易產生駐波，從而影響提取效果[1]。雙頻超聲強化提取法是一種頗具發展潛力的新的萃取技術，可將葛根中的有效成分快速高效地提取出來[2]。另外除了提取方式，葛根前處理也是影響有效成分提取的關鍵因素。超微粉碎可使葛根細胞壁破碎，促使細胞間和細胞內有效成分直接釋放出來，提高葛根中有效成分的溶出速度和溶出率。本試驗采用雙頻超聲輔助提取法對葛根超微粉進行提取，利用大孔樹脂吸附法對提取液進行純化，同時采用高效液相色譜法對葛根超微粉進行定量測定和有效成分質量檢測的研究。試驗將雙頻超聲技術與超微粉碎技術相結合，突破了傳統的萃取方法，旨在為葛根生產加工實踐提供理論參考。

1　材料與儀器

葛根：產自云南；葛根素標準品：中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇：天津市恒昊公司化學試劑廠；大孔吸附樹脂NKA-2：南開大學化工廠。

YM-40C研磨式超微粉碎機：青州市邁德森制藥機械廠；BILON-2009型智能溫控雙頻超聲波萃取儀：上海比朗儀器制造有限公司；Thermo Fisher R404A離心機：賽默飛世爾科技公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；Agilent1100型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

2　方法

2.1樣品處理

將葛根洗凈、晾干、切片、烘干，用粉碎機將葛根片粉碎后過80目篩得葛根粗粉。將葛根粗粉經過超微粉碎后過300目篩得到的細粉即為葛根超微粉[3]。

2.2葛根總黃酮的提取及含量測定

采用25/35 kHz、電功率200 W的雙頻超聲和25 k Hz、電功率200 W的單頻超聲分別對葛根超微粉進行處理，以40%乙醇為提取劑，葛根超微粉的投料量為5 g，固液比1∶20（g/mL），超聲溫度50℃，超聲時間30 min，提取后離心取上清液，剩余濾渣繼續超聲提取，分別提取4次，所得提取液在紫外分光光度計上250 nm波長處測吸光度值，并計算葛根黃酮含量。

式中：X為濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；W為樣品重量，g。

2.3葛根黃酮的純化

2.3.1大孔樹脂的純化

樣品提取液的濃度為13 mg/mL，按1 mL/min的流速通過NKA-2大孔吸附樹脂，同時檢測收集液，直至吸附飽和出現泄漏點，停止上樣，再用2 BV蒸餾水洗脫，然后用5 BV20%乙醇溶液，3 BV/h洗脫[4]，每5 mL收集一管流出液，備用檢測。

2.3.2樣品固形物含量的測定

精密量取純化前后的樣品液各5 mL，置于干燥恒重的蒸發皿中，70℃烘箱中蒸干至恒重，取出立即放入干燥器中，待至常溫后迅速稱量[5]。

式中：W1為培養皿烘干后恒重，mg；W2為培養皿+樣品液烘干后的恒重，mg；V1為樣品液體積，mL。

2.3.3葛根素的含量測定

色譜條件：AgilentC18柱，柱溫25℃，波長250 nm，流動相：甲醇-0.1%磷酸（25∶75）（體積比），流速0.8 mL/min，進樣量5μL，進樣時間30 min/個。

葛根素標準品的配制：精密稱取葛根素5 mg，加30%乙醇5mL，充分溶解得到1 mg/mL葛根素標準品溶液。

將葛根素標準品溶液和樣品溶液分別通過0.45μm濾膜過濾至1.5 mL樣品瓶中，進行HPLC檢測，通過峰面積測定葛根素含量。

3　結果與分析

3.1葛根素標準曲線的制作

用30%乙醇配制濃度為1 mg/mL標準品溶液，再用95%乙醇將其稀釋至濃度為0.1 mg/mL，從中精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于小試管中，并各加95%乙醇補充至1 mL，再分別加蒸餾水4 mL稀釋，搖勻。同時精密吸取95%乙醇1 mL，置小試管中，加水4 mL搖勻，作為空白對照溶液。250 nm波長處測吸光度值，繪制標準曲線圖，見圖1。

圖1　葛根素標準曲線Fig.1　Standard curve of puerarin

3.2雙頻超聲和單頻超聲輔助提取對葛根總黃酮含量的影響

雙頻超聲和單頻超聲輔助提取對葛根總黃酮含量的影響見圖2。

圖2　雙頻超聲和單頻超聲輔助提取對葛根超微粉中總黃酮含量的影響Fig.2　The influence of dual-frequency ultrasonic-assisted and single frequency ultrasonic-assisted extraction on the flavonoidscontent of the Pueraria submicron powder

由圖2可以看出，在雙頻超聲和單頻超聲處理下，葛根超微粉的4次提取過程中，第1次的黃酮提取效率均在80%以上。將4次提取的量相加得出，雙頻超聲提取中總黃酮含量為275.16 mg/g，明顯高于單頻超聲提取的190.8 mg/g，這說明雙頻超聲可以增大振幅，擴大傳質面積，使聲場比較均勻，產生比單頻超聲更強烈的空化效應[1]。超微粉碎可以將葛根細胞壁破碎，細胞中的有效成分溶出快而且溶出率高，相應提取的總黃酮含量就高。可見，將雙頻超聲技術與超微粉碎技術相結合可以促進葛根有效成分的提取，更好地使

其功能成分得到有效利用。

3.3葛根素標準品和葛根樣品的HPLC圖譜

葛根素標準品和葛根樣品的HPLC圖譜見圖3、圖4、圖5。

圖3　葛根素標準品液相色譜圖Fig.3　HPLC figure ofpuerarin standard substance

圖4　純化前樣品中葛根素液相色譜圖Fig.4　HPLC figure ofpuerarin in the sample before purification

圖5　純化后樣品中葛根素液相色譜圖Fig.5　HPLC figure of puerarin in the sample after purification

對葛根素標準品溶液和純化前后的樣品溶液進行HPLC檢測。從圖3可以看出，在250 nm處，葛根素標準品出峰時間為11.224 min，而且峰型陡峭、對稱，沒有雜峰。圖4和圖5在11.157 min和11.209 min均出現一個明顯的最大吸收峰，與標準品的出峰時間基本吻合，可以推斷出該峰為葛根素峰。從樣品溶液的HPLC圖譜來看，除了葛根素這個主峰之外，其余雜峰都非常小，這說明葛根素在葛根總黃酮中占有很大成分[6]。

3.4純化前后超微粉中葛根素含量的測定

以NKA-2樹脂為吸附劑，20%乙醇溶液為洗脫劑，以1 mL/min的流速進樣，對葛根超微粉提取液進行純化。純化前后葛根超微粉中葛根素含量的比較見表1。

表1　純化前后葛根超微粉中葛根素含量的比較Table 1　The comparison of the puerarin contentin the Pueraria submicron powder before and after purification

由表1可以看出，樣品中葛根素含量由純化前的11.15%提高到82.47%。可見，大孔樹脂吸附法對葛根黃酮的純化是可行有效的[7]，也是提取高純度葛根黃酮有效成分的較好的方法。

4　討論

1）本試驗采用雙頻超聲技術與超微粉碎技術相結合的方法進行葛根黃酮的提取，突破了傳統的萃取方法，大大提高了葛根黃酮含量。與單頻超聲相比，雙頻超聲會產生更強烈的空化效應，提取效果更顯著。超微粉碎技術能夠提高植物細胞破壁率，顯著提高有效成分的釋放速度和釋放量，從而提高生物利用度[8]。

2）大孔樹脂吸附法是一種簡單、安全、快速的分離純化方法[9]，避免了用有機溶劑純化而造成的成本高、回收難、損耗大、對環境污染等缺點。本研究采用的NKA-2型大孔樹脂對葛根黃酮具有良好的分離純化效果，其中葛根素含量由純化前的11.15%提高到82.47%。

3）試驗采用HPLC法測定葛根中葛根素的含量，具有樣品用量小、分離效果好、操作簡便、準確可靠等優點，可為葛根超微粉質量控制和后續開發提供精確的檢測方法[10]。

[1]張曉燕,丘泰球,徐彥淵,等.雙頻超聲強化提取葛根有效部位的研究[J].食品工業科技,2006,27(3):51-54

[2] 賁永光,丘泰球.雙頻超聲對海金沙中黃酮提取率影響的研究[J].食品與生物技術學報,2006,25(4):51-55

[3]張加梅,陳光芝,褚新紅.超微粉碎對提取葛根藥材中總黃酮、多糖的影響[J].中國藥業,2008,17(10):45-46

[4]李適,岳明珠,李銀花,等.正交試驗優化葛根素的大孔樹脂純化工藝[J].食品科學,2013,34(16):89-92

[5]楊欣欣,雷雪霏,曹愛民,等.葛根超微粉仿生提取條件的研究[J].遼寧化工,2008,37(3):148-149

[6]董華強,劉福來,林麗超,等.合水粉葛異黃酮含量的紫外分光光度法和HPLC法分析研究[J].食品科學,2008,29(10):477-479

[7]劉杏榮.葛根異黃酮的檢測方法與提取純化工藝研究[D].鎮江:江蘇大學,2007:57

[8]任少偉,張文成,李兵,等.HPLC法測定葛根超細粉中葛根素含量[J].包裝與食品機械,2014,32(3):67-69

[9]肖衛民.葛根總黃酮的微波輔助萃取與大孔樹脂純化[D].重慶:西南農業大學,2004:29

[10]夏虹,彭茂民,周有祥.葛根超微粉、葛粉中葛根素、大豆甙和大豆甙元的分析研究[J].應用化工,2010,39(10):1601-1603

Dual-frequency Ultrasonic-assisted Extraction and Purification on Flavonoids of Pueraria Submicron Powder

YANG Li-wei，CHEN Ying，ZHANG Jun
（Tianjin Research Institution of Forestry and Pomology，Tianjin 300384，China）

Pueraria submicron powder was used as raw material.Pueraria flavonoids was extracted by dual-frequency ultrasonic strengthening methods，purified by macroporous resin adsorption method.And the content of puerarin was determined by the HPLC method.The results showed that，the flavonoids contentofdual-frequency ultrasonic-assisted extraction was 275.16 mg/g，significantly higher than 190.8 mg/g of single frequency ultra－sonic-assisted extraction，that was dual-frequency ultrasonic-assisted technology and the superfine grinding technology could promote the combination ofthe extraction ofeffective components.The content of puerarin increased from 11.15%to 82.47%by purification which was good purification effect.

Pueraria；submicron powder；flavonoids；dual-frequency ultrasonic-assisted extraction；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.015

楊麗維（1981—），女（漢），助理研究員，碩士，主要從事農產品加工方面的研究工作。

2016-03-21