出芽短梗霉聚蘋果酸發酵條件的優化

殷海松，邊艷慧，湯衛華，范栩嘉，劉鵬，喬長晟，*（1.天津現代職業技術學院生物工程學院，天津0050；.天津輕工業化學研究所有限公司，天津0050；.工業發酵微生物教育部重點實驗室（天津科技大學），天津00457）

出芽短梗霉聚蘋果酸發酵條件的優化

殷海松1，2，邊艷慧3，湯衛華2，范栩嘉3，劉鵬2，喬長晟3，*
（1.天津現代職業技術學院生物工程學院，天津300350；2.天津輕工業化學研究所有限公司，天津300350；3.工業發酵微生物教育部重點實驗室（天津科技大學），天津300457）

在5 L發酵罐上，對出芽短梗霉PMLA發酵條件進行了研究，確定出芽短梗霉PMLA發酵的最優條件。由試驗結果可知：優化的發酵溫度為分階段調節，即0～24 h設定發酵溫度為30℃，24 h以后調節發酵溫度為25℃；攪拌轉速400 r/min；通風比1∶1.2。在此條件下，出芽短梗霉PMLA發酵獲得的最大生物量為38.7 g/L；聚蘋果酸產量為45.2 g/L；生產強度為0.38 g/（L·h）和PMLA分子量為8 412 Da。

出芽短梗霉；聚蘋果酸；溫度；攪拌轉速；通風比

聚蘋果酸，簡稱PMLA，是一種水溶性脂肪族聚酯類化合物[1-2]，由于主鏈上含有酯鍵而被稱為聚酯類化合物，在有水的環境中可以自發降解或者發生酶促反應而被降解。聚蘋果酸是以蘋果酸為唯一單體，相互通過酯鍵連接而成，主要有3種結構：α型、β型和γ 型3種，惟一存在于生物體內的只有β型聚蘋果酸[3]?？梢杂米魉幬镙d體及微膠囊材料、生物醫學材料等[4]。生物途徑制備的聚蘋果酸主要是通過微生物發酵合成，生物合成PMLA具有突出的優點，通過微生物發酵，產物均為β型、產物分子量高、生產條件溫和、生成產物純度較高，但微生物發酵生產PMLA產量不高[5]，成本巨大是困擾發酵制備PMLA的主要問題。

本文旨在利用5 L發酵罐分析發酵溫度、攪拌轉速以及通風比3個參數對出芽短梗霉聚蘋果酸合成的影響，根據發酵過程中得到的發酵動力學參數，對發酵條件進行分階段的調控，提高發酵效率，為下一步的中試打下堅實的基礎。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌株

出芽短梗霉A.pullulans CGMCC3337：天津北洋百川生物技術有限公司贈送。

1.1.2培養基

1.1.2.1斜面培養基

稱取馬鈴薯200 g，切成1 cm3大小的方塊，加入1 000 mL蒸餾水煮沸0.5 h，用四層紗布進行過濾，在上清液中加入20 g剪碎的瓊脂條加熱至完全溶解，再加入20 g葡萄糖攪拌至完全溶解，補水至1 000 mL，pH自然。

1.1.2.2種子培養基

蔗糖60 g/L，酵母膏3 g/L，丁二酸2 g/L，硫酸銨1 g/L，K2CO30.4 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L， ZnSO4·7H2O 0.005 g/L，玉米漿0.1%，CaCO320 g/L（單獨滅菌）。

1.1.2.3基礎發酵培養基

蔗糖 100 g/L，蛋白胨 35 g/L，KH2PO40.1 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KCl 0.5 g/L，MnSO40.05 g/L，CaCO320 g/L（單獨滅菌）。

1.1.3儀器與設備

UVmini-1240紫外/可見分光光度計：日本島津公司；SKY-2102搖床：上海蘇坤實業有限公司；YJ-875S醫用超凈臺：蘇州凈化設備廠；SPK-250B-Z生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；LD5-10高速離心機：北京醫用離心廠；Agilent1100高效液相色譜分析儀：美國Agilent；色譜柱：凝膠色譜柱（8.0 mm× 300 mm）。

1.2方法

1.2.1培養方法

1.2.1.1斜面培養

將保存于4℃的斜面取出用接種針轉接到新鮮的斜面上，并置于25℃恒溫培養箱中，培養4 d～5 d。

1.2.1.2種子培養

取出培養好的新鮮斜面，在無菌操作條件下，用10 mL無菌生理鹽水將培養基表面的孢子洗下，置于預先加好玻璃珠的無菌三角瓶內搖勻，制成孢子懸液。將該孢子懸液按照10%的接種量，即取5 mL接種到裝有45 mL種子培養基并滅好菌的500 mL擋板瓶中，用八層紗布封好瓶口，置于25℃恒溫搖床上，轉速200 r/min培養40 h。

1.2.1.3發酵罐發酵方法

接種口在火焰保護下，按照10%的接種量，將300 mL混合均勻的種子液接種到5 L全自動控制發酵罐中，罐內初始裝液量為3 L，轉速為300 r/min～600 r/min，通風比1∶1～1∶1.4，發酵溫度為恒定25、28℃及30℃，發酵時間為144 h。

1.2.2分析方法

1.2.2.1菌體量測定

取10 mL發酵液于50 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min。倒掉上清，在菌體沉淀中滴加3 mol/L的稀鹽酸溶液，中和發酵液中剩余的碳酸鈣，直到不再有氣泡產生為止，5 000 r/min離心15 min，倒掉上清。用10 mL生理鹽水重懸菌體，5 000 r/min離心15 min，倒掉上清，將離心管置于80℃烘箱中烘干至恒重，稱量菌體干重（g/L）。

1.2.2.2發酵液中PMLA的測定[6]

取10 mL發酵液于15 000 r/min離心10 min除去菌體，用移液管取5 mL上清液于水解反應釜中，同時加入等體積的1 mol/L H2SO4溶液，于90℃條件下水解12 h，將聚蘋果酸完全水解為單體蘋果酸。高效液相色譜法（HPLC）檢測水解前后的蘋果酸的含量，兩者之差即為聚蘋果酸的產量。

1.2.2.3GPC測定PMLA分子量

采用凝膠滲透色譜法進行分子量的測定，首先使用分子量能夠覆蓋聚蘋果酸分子量的葡聚糖標準品進行標準曲線的繪制，再結合使用高效液相色譜儀和凝膠色譜柱測定發酵液中PMLA的分子量。最后根據標準曲線轉換即可得出PMLA的分子量。GPC檢測PMLA分子量的條件：色譜柱為凝膠色譜柱（8.0 mm× 300 mm）；柱溫25℃；參比池溫度30℃；流動相為0.05 mol/L Na2SO4溶液；pH自然；流速0.5 mL/min；進樣量20μL。

2　結果與討論

2.1發酵溫度對PMLA發酵的影響

發酵溫度對PMLA發酵的影響，結果如圖1、2、3和表1所示。

圖1　不同發酵溫度對菌體生長的影響Fig.1　Effectofdifferentfermentation temperature on cellgrowth

圖2　不同發酵溫度對PMLA合成的影響Fig.2　Effect of different fermentation temperature on PMLA production

圖3　不同發酵溫度對PMLA分子量的影響Fig.3　Effect of different fermentation temperature on PMLA molecular weight

表1　不同發酵溫度條件下發酵結果比較Table 1　Comparison of fermentation results under different temperature

當發酵溫度25℃時，獲得的PMLA產量和生產強度均為最大，分別為38.3 g/L、7 872 Da，0.32 g/（L·h）。然而菌體量則是在30℃發酵條件下最大為40.2 g/L。綜合分析溫度對出芽短梗霉菌體量、PMLA產量及分子量的影響，選擇分階段調節發酵溫度的方式，即0～ 24 h設定發酵溫度為30℃（適合大量積累菌體），24 h以后調節發酵溫度為25℃（適合聚蘋果酸的合成）。

2.2攪拌轉速對PMLA發酵的影響

攪拌轉速對PMLA發酵的影響，結果如圖4、5、6和表2所示。

從圖和表中可以看出，當轉速400 r/min時，有利于出芽短梗霉菌體生長和PMLA的合成，獲得的最大生物量、PMLA產量、PMLA分子量和生產強度，分別為37.7 g/L、42.7 g/L、7819 Da和0.36 g/（L·h）。由于攪拌轉速過高和過低都不利于菌體生長和PMLA合成，當攪拌轉速300 r/min和600 r/min時，聚蘋果酸產量和出芽短梗霉生物量分別為30.2、34.5 g/L和32.3、35 g/L，分別比攪拌轉速400 r/min時降低了41.4%、24.0%和16.9%、8%。綜合以上各項指標，當轉速為400r/min時最適合出芽短梗霉聚蘋果酸的發酵，因此選定400 r/min作為聚蘋果酸發酵的攪拌轉速。

圖4　不同攪拌轉速下菌體生長曲線Fig.4　Time course of cellgrowth under differentagitation rates

圖5　攪拌轉速對PMLA發酵的影響Fig.5　Effectofagitation rates on PMLA synthesis

圖6　不同攪拌轉速對PMLA分子量的影響Fig.6　Effectofagitation on PMLA molecular weight

表2　不同轉速條件下發酵結果比較Table 2　Comparison of fermentation results under different agitation

2.3通風比對PMLA發酵的影響

不同的通風比對出芽短梗霉PMLA發酵的影響，結果如圖7、8、9和表3所示。

圖7　通風比對菌體生長的影響Fig.7　Effectofaeration rate on cellgrowth

圖8　通風比對PMLA合成的影響Fig.8　Effectofaeration rate on PMLA production

圖9　通風比對PMLA分子量的影響Fig.9　Effect of aeration rate on PMLA molecular weight

表3　不同通風比條件下發酵結果比較Table 3　Comparison of fermentation results under different aeration rate

當通風比為1∶1.2時，獲得的PMLA產量、PMLA分子量和生產強度均為最大，分別為43.4 g/L、7 919 Da，0.362 g/（L·h）。當通風比為1∶1和1∶1.4時，發酵結束時PMLA產量和PMLA分子量相對較低，分別為37.9 g/L、30 g/L和5 573 Da、4 689 Da，分別比通風比1∶1.2時降低了14.5%、31.0%和42.1%、68.9%。然而出芽短梗霉生物量則是在通風比1∶1.4時獲得最大為40.2 g/L，可能是由于高溶氧條件有利于出芽短梗霉的快速生長，導致菌體量積累過大，對產物聚蘋果酸合成不利。綜合以上各項指標，尤其是PMLA產量和生產強度，當通風比為1∶1.2時最適合出芽短梗霉聚蘋果酸的發酵，因此選擇1∶1.2作為聚蘋果酸發酵的通風比。

2.4最優條件下的PMLA發酵過程曲線

在研究發酵溫度、攪拌轉速和通風比等因素對聚蘋果酸發酵影響的過程中，確定攪拌轉速為400 r/min和通風比為1∶1.2條件下對出芽短梗霉菌體生長和聚蘋果酸的合成最有利，聚蘋果酸分子量也相對較高。通過調節發酵溫度來滿足菌體生長的需求，在0～24 h調節發酵溫度為30℃，使菌體得到一定的積累，24 h以后調節發酵溫度為25℃，在菌體大量積累的同時合成聚蘋果酸，優化條件下的聚蘋果酸發酵過程曲線如圖10所示。

圖10　最優條件下的PMLA發酵過程曲線Fig.10　The PMLA fermentation curve on the optimalconditions

在優化條件下，PMLA發酵獲得的最大出芽短梗霉生物量為38.7 g/L、聚蘋果酸產量為45.2 g/L和生產強度為0.38 g/（L·h）。同時獲得較高的PMLA分子量為8412 Da，分子量是評價作為藥物載體性能的重要指標，能夠用作藥物載體的聚合物分子量范圍是1.5 kDa～ 200 kDa，在該范圍內，適當提高聚蘋果酸分子量，可以提高其載藥量，而當分子量過高時，則難以穿過細胞膜而失去作為藥物載體的性能。

3　結論

在5 L發酵罐上，對出芽短梗霉在不同發酵溫度、攪拌轉速和通風比條件下PMLA發酵過程進行了研究，主要結論如下：

綜合分析溫度、攪拌轉速和通風比對出芽短梗霉菌體量、PMLA產量、生產強度和PMLA分子量的影響，確定出芽短梗霉PMLA發酵條件為：發酵溫度分階段調節，即0h～24 h設定發酵溫度為30℃，24 h以后調節發酵溫度為25℃；攪拌轉速400 r/min；通風比1∶1.2。在此條件下，經5L發酵罐發酵獲得的最大出芽短梗霉生物量為38.7 g/L、聚蘋果酸產量為45.2 g/L、生產強度為0.38 g/（L·h）和PMLA分子量為8 412 Da。

[1]Shimada K,Matsushima K,Fukumoto J．Poly-L-malic acid a newproteaseinhibitorfrom Penicillium cyclopium[J]．Biochem Biophys ResCo mmun,1969,35(5):619-624

[2]Fernandez CE,Mancera M,Holler E．High molecular weightmethyl ester of microbial poly(β,L-malic acid)Synthesisand crystallization [J]．Polymer,2006,47(19):6501-6508

[3]Nagata N,Nakahara T,Tabuchi T.Fermentative production of poly (β-L-malic acid),a polyelectrolytic biopolyester,by Aureobasidium sp[J].Biosci Biotech Biochem,1993,57(4):638-642

[4]Phillppe Guerin,MichelVert,Christian Braund,etal.Drug carriers: Optically Active Poly(β-malic acid)[J].Polymer Bulletin,1985,14 (2):187-192

[5]Pinchai N,Lee B S,Holler E.Stage specific expression ofpoly(malic acid)-affiliated genes in the life cycle of Physarum polycephalum. Spherulin 3b and polymalatase[J].FEBS Journal2006,27(3):1046-1055

[6]喬長晟,姜少麗,馬正旺,等．反向高效液相色譜測定發酵液中的聚蘋果酸[J]．現代食品科技,2012,28(4):453-455

Optimization of Fermentation Conditions for Poly Malic Acid（PMLA）Production of
Aureobasidium pullulans

YIN Hai-song1，2，BIAN Yan-hui3，TANG Wei-hua2，FAN Xu-jia3，LIU Peng2，QIAO Chang-sheng3，*
（1.Schoolof Bioengineering，Tianjin Modern VocationalTechnology College，Tianjin 300350，China；2.Tianjin LightIndustrial Institute of Chemical Co.，LTD.，Tianjin 300350，China；3.Key Laboratory of IndustrialFermentation Microbiology（Tianjin University ofScience&Technology），Ministry ofEducation，Tianjin 300457，China）

In the 5 L fermenter，the fermentation conditions of Aureobasidium pullulans PMLA were studied and the optimalfermentation conditions of Aureobasidium pullulans PMLA was determined.The reshlts showed that：optimization ofthe fermentation temperature was divided into stages，the fermentation temperature in the 0-24 h was 30℃，the fermentation temperature after 24 h was 25℃；agitation speed was 400 r/min；aeration rate was 1∶1.2.Under this condition，the maximum biomass of Aureobasidium pullulans PMLA fermentation was 38.7 g/L；poly malic acid production was 45.2 g/L；production intensity of 0.38 g/（L·h）and PMLA molecular weight was 8 412 Da.

Aureobasidium pullulans；poly malic acid；temperature；stirring speed；aeration rate

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.020

天津市科技支撐計劃重點項目（14ZCZDTG00025）

殷海松（1980—），男（漢），副教授，碩士研究生，研究方向：發酵工程。

喬長晟（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：發酵工程。

2015-11-03