響應面法優化超聲輔助提取夏枯草多糖工藝

趙志剛，宣麗英，李志英，高瑞苑，張海容（忻州師范學院生化分析技術研究所，山西忻州034000）

響應面法優化超聲輔助提取夏枯草多糖工藝

趙志剛，宣麗英，李志英，高瑞苑，張海容*
（忻州師范學院生化分析技術研究所，山西忻州034000）

通過響應曲面法優化超聲提取夏枯草中多糖類化合物的工藝，在單因素試驗的基礎上，選擇提取功率、提取溫度、提取時間、液固比和提取次數5個因素，利用Box-Benhnken中心組合試驗和響應面分析法，研究了各自變量交互作用及其對夏枯草多糖產率的影響，模擬得到二次多項式回歸方程的預測模型。結果表明：夏枯草中多糖類化合物的最佳超聲輔助提取工藝為：提取功率90 W、提取溫度65℃、液固比40∶1（mL/g）、時間52 min、提取次數兩次，夏枯草中多糖類的實測結果（4.60%）與響應面擬合方程的預測值（4.64%）符合良好。

夏枯草；響應面法；多糖；超聲輔助提取

夏枯草（Prunella vugaris L.）為唇形科夏枯草屬植物，多年生草本，為常用中藥。主要生長于疏林、荒山、田埂及路旁，花期4月～6月，果期7月～10月。由于此草夏至后即枯，故有此名，主產于江蘇、安徽、浙江、河南等省。夏枯草性寒，味甘、辛、微苦，具有清泄肝火、明目、清熱解毒、祛痰止咳、涼血止血、利尿的功效?，F代藥理研究表明，夏枯草有降低血壓的作用。夏枯草的干燥果穗和全草均可入藥也可制作美味佳肴[1-3]。夏枯草含有多種活性化學成分，其中多糖具有抗菌、降壓、消炎、抗腫瘤、降血糖等獨特的藥理功能[4-6]，在臨床方面具有獨特的應用前景。

文獻中關于夏枯草的藥理研究、栽培、化學成分、產品開發等及夏枯草中多糖的提取技術已有不少報道，但有關響應面優化-超聲輔助提取夏枯草中多糖的技術鮮見報道。多糖是夏枯草中的重要活性成分，本試驗針對夏枯草多糖具有抗腫瘤、抗病毒等藥理作用，研究夏枯草中多糖的提取方法，應用硫酸-苯酚法測定夏枯草中多糖的含量，為夏枯草的進一步研究和開發利用提供科學參考。

1　儀器與材料

1.1材料及試劑

夏枯草：產地江蘇，購自忻州市老藥工藥店，恒溫50℃烘干，粉碎過60目篩，保存備用；葡萄糖（分析純）：北京化學試劑公司；苯酚（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；濃硫酸（98%）：天津市耀華化學試劑有限公司。

1.2試驗儀器

Al204型電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ3200DV型數控超聲波清洗器：超聲功率150 W，超聲頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司；723型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司。

2　方法

2.1工作曲線和回歸方程

用移液管分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL100μg/mL的葡萄糖標準溶液于9支比色管中，用二次蒸餾水補充至2 mL，加5%的苯酚溶液各1 mL，再加98%的濃硫酸各5 mL，靜置0.5 h、冷卻至室溫，在最大吸收波長490 nm處，以試劑空白為參比，測定吸光度值，并以吸光度值A為縱坐標，濃度C （μg/mL）為橫坐標繪出標準曲線，回歸方程為A= 0.047 6C-0.023 3，R2=0.996 8。

2.2樣品中多糖化合物含量的測定

準確稱取樣品0.200 0 g于試管中，超聲提取后，抽濾，定容至100 mL容量瓶中，搖勻。移取25 mL于50 mL的容量瓶中進行稀釋2倍，然后從50 mL容量瓶中移夏枯草中多糖類化合物的產率。

多糖產率/%=C×D×f÷W×100

式中：C為供試液中葡萄糖濃度，mg/mL；D為多糖的稀釋因素，mL；f為換算因子；W為供試夏枯草樣品的重量，mg。

2.3響應面試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Benhnken的中心組合設計原理，4個主要因素超聲功率、超聲溫度、液固比和超聲時間分別用A、B、C、D、來表示，每一個自變量的低、中、高試驗水平分別以-1、0、+1進行編碼。試驗因素與水平設計見表1。

表1　試驗因素水平及編碼Table 1　Experimentalfactors leveland coding

3　結果與分析

3.1單因素試驗

3.1.1超聲功率對多糖產率的影響

在提取溫度為65℃，提取時間為30 min，液固比為40∶1（mL/g），研究超聲波功率在60 W～150 W時對多糖產率的影響，結果見圖1。

圖1　超聲功率對多糖產率的影響Fig.1　The influence of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharide

由圖1可知隨超聲波功率的增加，產率提高，直到超聲波功率達到90 W時，產率達到最大，再增加超聲功率，產率反而會有所下降，最后達到穩定。因此，從節能的角度考慮，在響應曲面優化試驗中，選90 W左右為最佳。

3.1.2超聲溫度對多糖產率的影響

提取功率為90 W，提取時間為30 min，液固比為40∶1（mL/g），研究超聲溫度對產率的影響，結果見圖2。

圖2　超聲溫度對多糖產率的影響Fig.2　The influence of ultrasonic temperature on extraction yield ofpolysaccharide

由圖2可知，隨著溫度的升高產率增大，直至達到穩定。當溫度為65℃時，多糖的產率最大。所以選65℃左右為最佳。

3.1.3液固比對多糖產率的影響

提取溫度為65℃，提取時間為30 min，超聲波功率為90 W，研究液固對多糖產率的影響，結果見圖3。

由圖3可知隨著液固比的增加，多糖的產率逐漸增加，當達到40∶1（mL/g）時，多糖的產率達到最大，再增加液固比多糖產率下降，因此選用40∶1（mL/g）左右最佳。

圖3　液固比對多糖產率的影響Fig.3　The influence ofliquid-solid ratio on extraction yield of polysaccharide

3.1.4超聲時間對多糖產率的影響

提取溫度為65℃，液固比為40∶1（mL/g），超聲波功率為90 W，研究提取時間對多糖產率的影響，結果見圖4。

圖4　超聲時間對多糖產率的影響Fig.4　The influence of ultrasonic time on extraction yield of polysaccharide

由圖4可知，隨著提取時間的增加，產率逐漸提高，直到50 min達到最高值。因此選取超聲時間為50 min左右為宜。

3.1.5提取次數對多糖產率的影響

提取次數對多糖產率的影響見圖5。

圖5　提取次數對多糖產率的影響Fig.5　The influence of extraction times on extraction yield of polysaccharide

由圖5可知，提取第一次的多糖產率為4.36%，提取第二次的多糖產率為1.28%，提取第三次的多糖產率為0.48%，比較3次提取發現第二次提取占第一次的29%，而第三次提取占第一次的11%，考慮到增加提取次數，會增加生產成本，選取提取2次。

3.2提取工藝條件響應曲面優化試驗

以A=（a-90）/30，B=（b-65）/10，C=（c-40）/10，D=（d-50）/10為自變量，以多糖化合物產率為響應值（P），進行響應曲面分析試驗。響應曲面試驗設計及結果見表2。

表2　Box-Behnken中心組合設計方案及試驗結果Table 2　Box-Behnken experimentdesign and the results of these experiments

用Design Expert7.0.0軟件對試驗數據進行回歸擬合分析，得到多糖化合物產率與各因素變量的二次多項回歸方程模型：對模型進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，本試驗所選模型不同處理間差異及（P=0.000 2<0.05），R2=0.892 4和Adeq Precisior（信噪比）等于9.024，遠大于4，說明回歸方程的擬合度和可信度均較高[7]。模型響應值的變異系數CV值為4.36%小于5%，表明試驗操作是可信的。從回歸模型系數的顯著性檢驗結果可知，模型的一次項D是顯著的，二次項A2、B2、C2、D2都是顯著的，交互項AB是顯著的。說明各因素對多糖化合物產率的影響不是簡單的線性關系。

表3　回歸模型方差分析及模型系數顯著性檢驗Table 3　Analysis of asriances and significance test of coefficients for the created regression model

3.2.1響應面圖分析

響應面圖分析見圖6～圖11。

圖6　超聲功率與超聲溫度對多糖產率的影響Fig.6　The influence of Ultrasonic power and ultrasonic temperature on extraction yield of polysaccharide

對表2數據進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應面圖如圖6～圖11所示。由圖可見，6個響應曲面均均呈現凸球形曲面，說明兩因素間交互作用非常顯著。同時，其投影等高線最小橢圓的中心全部落在所選的-1～1范圍內，響應值（夏枯草多糖）在4個因子設計的范圍內呈現極大值。

圖7　超聲功率與液固比對多糖產率的影響Fig.7　The influence of ultrasonic power and liquid-solid ratio on extraction yield of polysaccharide

圖8　超聲時間和超聲功率對多糖產率的影響Fig.8　The influence of ultrasonic time and ultrasonic power on extraction yield of polysaccharide

圖9　液固比和超聲溫度對多糖產率的影響Fig.9　The influence of Liquid-solid ratio and temperature on extraction yield of polysaccharide

圖10　超聲時間和超聲溫度對多糖產率的影響Fig.10　The influence of ultrasonic time and temperature onextraction yield ofpolysaccharide

圖11　超聲時間和液固比對多糖產率的影響Fig.11　The influence of ultrasonic time and solid-liquid ratio on extraction yield ofpolysaccharide

3.2.2最優工藝條件驗證

P=1.15+0.024A+0.017B+0.018C+0.033D-0.052AB-0.038AC-7.500×10-3AD-2.500×10-3BC+ 0.020BD-0.057A2-0.089B2-0.15C2-0.07D2

求解方程組得：A=0.070 3；B=-0.009 8；C=0.051 2；D=0.209 6。即超聲功率為92.11 W、超聲溫度為64.90℃、液固比為40.51∶1（mL/g）、超聲時間為52.10 min，此時多糖產率理論值可達到4.64%。在試驗條件允許的條件下選取超聲功率為90 W，超聲溫度為65℃、液固比為40∶1（mL/g）、超聲時間為52 min，驗證試驗表明，產率為4.60%，與理論值相符較好。因此，采用響應面法得到的提取條件參數相對可靠，具有使用價值。

3.2.3超聲輔助提取法與常規溶劑提取法的對比試驗

準確稱取10.00 g的夏枯草粉末，按40∶1（mL/g）的液固比加400 mL二次蒸餾水于1 000 mL大燒杯中進行溶解后，在80℃的恒溫水浴鍋中加熱8 h，然后抽濾，收集濾液，將濾渣重新用400 mL二次蒸餾水進行溶解后，與第一次同樣的溫度下再次恒溫加熱8 h，然后抽濾，收集濾液。將兩次收集的濾液合并后用旋轉蒸發儀蒸發掉其中的部分水分，將剩余的濾液定容到250 mL的容量瓶中。稀釋40倍，進行吸光度的測定。根據2.2中計算多糖產率的公式進行計算，得到多糖的產率為4.16%。試驗結果見圖12。

由圖12可看出，同樣的液固比條件下，超聲輔助提取夏枯草中的多糖化合物，其產率遠遠優于常規溶劑提取法。原因是超聲波的空化效應使得夏枯草細胞被均勻破壞，多糖化合物較易溶出，而常規溶劑提取法盡管提取時間很長（16 h），但細胞結構沒有遭到破壞，多糖化合物傳質阻力較大，從而產率較低。

圖12　超聲提取法與常規溶劑提取法的對比實驗結果Fig.12　Comparison of ultrasonic and conventional solvent extraction technology

4　結論

利用由響應面法得到的模型進行探討，得到夏枯草中多糖化合物的超聲輔助提取過程優化的工藝條件：超聲功率為90 W、超聲溫度為65℃、液固比為40∶1（mL/g）、超聲時間為52 min、超聲提取次數為兩次，此時多糖產率可達4.6%。因此，采用響應面法獲得的夏枯草中多糖化合物的超聲輔助提取工藝條件，數據準確，科學可行。超聲輔助提取法與常規溶劑提取法的對比試驗結果表明，采用超聲輔助提取工藝提取夏枯草中的多糖化合物，產率遠遠優于常規溶劑提取工藝。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Polysaccharide from
Prunella vulgaris L.by Response Surface Methodology

ZHAO Zhi-gang，XUAN Li-ying，LIZhi-ying，GAO Rui-yuan，ZHANG Hai-rong*
（Lab of BiochemicalAnalysis，Xinzhou Teachers College，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

The ultrasonic-assisted extraction process of polysaccharide of Prunella vulgaris L.was studied. Based on the experiment of single factor，the mathematical regression model was established about the dependentvariable（extraction yield ofpolysaccharide）and independent variables（extraction power，extraction temperature，extraction time，ratio of liquid to soild，extraction times）though Box-Benhnken center composite design and response surface methodology.The results showed that the optimum extraction condition were as follow：extracting power of 90 W，extracting temperature was 65℃，the ratio of liquid to solid was 40∶1（mL/g），extracting time of52 min，and extraction times of2.Under these conditions，the practicalyield ofpolysaccharide of Prunella vulgaris L.was 4.60%，which was consistentwith the predicted yield ofpolysaccharide of4.64%.

Prunella vulgaris L.；response surface methodology；polysaccharide；ultrasonic-assisted extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.021

忻州師范學院重點學科建設項目資助計劃（xk201402）；山西省高等學校教學改革項目（2015-100）；山西省教育廳重點建設學科項目（20141010）

趙志剛（1964—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：天然植物分離及分析。

張海容（1957—），男（漢），教授，碩士生導師，博士，研究方向：有機分析。

2015-05-19