響應面法優化復合酶酶解牡蠣蛋白的工藝研究

文志州（佛山市海天調味食品股份有限公司，廣東佛山528000）

響應面法優化復合酶酶解牡蠣蛋白的工藝研究

文志州
（佛山市海天調味食品股份有限公司，廣東佛山528000）

為提高牡蠣蛋白的利用率，以新鮮牡蠣為原料，采用水解蛋白酶與風味蛋白酶對新鮮牡蠣進行復合酶解，并利用響應面法對牡蠣酶解工藝參數進行優化。結果表明：牡蠣蛋白的最優酶解條件為，復合酶的加酶量為0.70%、pH6.87，酶解溫度58.6℃，酶解時間為3.4 h。在此條件下，新鮮牡蠣酶解后的水解度最高，為40.71%。

牡蠣；復合酶解；響應面分析法；水解度

牡蠣又名蠔，是世界上第一大養殖海產貝類，全球發現有100多種，主要分布在熱帶和溫帶，為我國四大養殖貝類之一。我國沿海牡蠣分布較廣，自渤海、黃海至南沙群島均有生長，約有20種[1]。牡蠣肉鮮味美，營養豐富，素有“海底牛奶”之稱[2]，是我國首批列為藥食同源的保健食品之一[3]。牡蠣中的蛋白含量高達50%，其中必需氨基酸占氨基酸總量的40%，是一種優質的蛋白質資源。牡蠣肉中富含牛磺酸，牛磺酸具有消炎解毒、降血脂、促進幼兒大腦發育等作用[4]。此外，牡蠣肉的糖原含量豐富，約為22.41%，是一種重要的生理活性物質，可改善心臟和血液功能[5]。且蠔肉中還含有DHA和EPA等不飽和脂肪酸、維生素以及硒和鋅等礦物質，具有一定的保健功能[6]。

蠔汁是蠔油生產的主要原料，其質量優劣對蠔油的質量有重要的影響。目前，蠔汁的生產方式主要有兩種：一是煮制工藝，直接利用牡蠣蒸、煮后的汁液進行濃縮制得。另一種是酶解工藝，將蠔肉酶解，再對酶解液進行處理制得蠔汁[7]。通過酶解法制備蠔汁，不僅可以提高蛋白的利用率，還能增加酶解液中的營養成分及功能活性物質。酶解工藝多采用單酶或雙酶水解法，且采用的單酶多為胰蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶等[8-10]。雙酶多采用中性蛋白酶和風味蛋白酶等的組合[11]。本試驗采用水解蛋白酶與風味蛋白酶對牡蠣進行復合酶解，利用響應面法對牡蠣酶解工藝參數進行優化，得出了牡蠣雙酶酶解的最佳工藝條件，提高牡蠣肉的水解度，增加牡蠣蛋白的利用率，為牡蠣的深加工和綜合利用提供理論依據。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

新鮮牡蠣：海南東岸水產開發有限公司；風味蛋白酶（100 000 U/g）、水解蛋白酶（100 000 U/g）、中性蛋白酶（100 000 U/g）、木瓜蛋白酶（200 000 U/g）、復合蛋白酶（120 000 U/g）：諾維信公司；分析純氯化鈉、氫氧化鈉等：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

1030Analyzer定氮儀：Tetator；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱：北京市雅士林試驗設備有限公司；Delta 320 pH計：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；3-18K冷凍離心機：德國sigma。

1.3方法

1.3.1基本成分的測定

水分含量的測定：參照GB 5009.3-2010《食品安全國家標準食品中水分的測定》采用常壓干燥法進行；粗脂肪含量的測定：參照GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》采用索氏提取法；灰分含量的測定：參照GB 5009.4-2010《食品安全國家標準食品中灰分的測定》采用干法灰化法測定；粗蛋白含量的測定：參照GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測》采用凱氏定氮法測定；總糖含量的測定：參照GB/T 9695.31-2008《肉制品總糖含量測定》。

1.3.2蠔汁的制備工藝

取一定量的新鮮牡蠣，加入一定量的水，打漿處理，加入一定量的蛋白水解酶，在適宜的酶解條件下，酶解一定時間后，100℃煮沸10 min滅酶，冷卻后3 000 r/min離心15 min，得到蠔汁。

1.3.3蛋白質水解度的測定

水解度的測定采用甲醛滴定法[12]。水解度是指蛋白質分子中由于生物或化學水解而斷裂的肽鍵占蛋白質分子中總肽鍵的比例。DH/%=水解液中斷裂的肽鍵數/蛋白質中總的肽鍵數×100

1.3.4數據處理

試驗所涉及到的測定結果均做3次平行，試驗數據用Origin8.6進行數據處理，用SPSS軟件進行顯著性分析處理。

2　結果與討論

2.1蠔肉的主要成分分析

蠔肉的主要成分見表1。

表1　蠔肉的主要成分Table 1　Chemicalcomposition ofoyster meat

由表1可知，解凍后的蠔肉中的主要成分為水分，水分含量為80.64%，而蠔肉的干物質中，蛋白質的含量最高，占49.83%，且其氨基酸的組成較為合理，必需氨基酸含量較高，占氨基酸總量的40.00%，是一種優質蛋白質[13]。蠔肉中還含有約3.30%的牛磺酸，對人體具有很重要的生理活性[14]。其次是糖類，占干物質的24.08%，其中含有大量的活性多糖，能改善心臟和血液功能，對人體有良好的保健作用[15]。蠔肉中的脂肪含量較低，僅為7.14%，且其脂肪中的DHA、EPA等不飽和脂肪酸的比例較高，能改善和提高記憶力[6]。蠔肉中的灰分含量較高為9.49%，含有豐富的微量元素，特別是鋅和硒的含量豐富[17]。

2.2響應面優化水解蛋白酶與風味蛋白酶復合酶解牡蠣的工藝條件

在單因素試驗基礎上（單因素試驗結果為水解蛋白酶∶風味蛋白酶=2∶1（體積比），酶解溫度60℃、加酶量0.6%、pH=7、酶解時間3 h），選取加酶量（A）、pH （B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）4個因素為自變量，以水解度（Y）為目標函數，采用四因素三水平的響應面分析法進行試驗設計，其因素水平編碼表如表2所示。

表2　響應面優化因素及水平表Table 2　Factors and levels of RSMexperiment

根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，按表2的因素水平編碼表，以水解度（Y）為響應值，采用四因素三水平的響應面分析方法進行試驗設計，試驗設計及結果如表3所示。

表3　響應面分析方案及結果Table 3　Response surface experimentaldesign and results

續表3　響應面分析方案及結果Continue table 3　Response surface experimentaldesign and results

利用Design Expert8.0.6軟件對上表中的試驗結果作回歸擬合分析，得到Y水解度（%），A加酶量（%），B pH，C酶解溫度（℃），D酶解時間（h）二次項方程：Y=37.16＋2.79×A-2.95×B-1.13×C＋1.95×D-0.51×A× B-2.86×A×C＋0.35×A×D＋1.29×B×C＋-1.33×B×D-0.51× C×D－3.91×A2－3.40×B2－4.27×C2－0.66×D2。對方程分別進行顯著性方差分析和可信度分析，結果分別如表4和表5所示。

表4　二次回歸方程的顯著性檢驗及方差分析Table 4　ANOVA for response surface quadratic model

表5　二次回歸方程的可信度分析Table 5　The credibility analysis ofregression model

由上表可知：P﹤0.000 1，故該回歸模型極顯著，其中的一次項A、B、C、D和二次項A2、B2、C2表現為極顯著，二次項D2表現為顯著。而交互項AC、BC、BD表現為極顯著，AC、AD、CD表現為不顯著。由表6中F值可以看出，加酶量（A）、pH（B）、酶解溫度（C）及酶解時間（D）4個因素中，pH對牡蠣蛋白水解度的影響最大，其次是加酶量、酶解時間，最后是酶解溫度。同時失擬項P=0.340 6，為不顯著，表明失擬誤差相對于純誤差是不顯著的，同時該模型具有較好的回歸系數（R2=0.98）說明該試驗設計是可靠的，能夠很好地描述試驗結果。

圖1直觀地反映出各因素間的交互效應以及對牡蠣蛋白水解度的影響。

圖1　四因素的等高線圖及響應面三維分析圖Fig.1　Four-dimensionalchart and corresponding contour plot

其中酶解溫度-加酶量、pH-加酶量及酶解時間-加酶量的交互作用對牡蠣蛋白水解度的影響較為顯著。由圖1可知，其他幾種因素的交互作用對牡蠣蛋白水解度也存在一定影響。因此，當提取溫度、保溫時間、加酶量及酶解時間4個因素間合理組合時才能獲得較好的水解度。

綜合以上單因素試驗及響應面分析試驗結果，使用Design-expert軟件，得到水解度最高的新鮮牡蠣的復合酶解條件如下：加酶量為0.70%、pH=6.87，酶解溫度58.57℃，酶解時間為3.39 h時，酶解后的水解度最高，為40.50%。按照確定的最佳酶解條件進行3次實際酶解試驗，實際酶解條件為，加酶量0.70%、pH= 6.87、酶解溫度58.6℃、酶解時間3.4 h，并測定此時酶解液的水解度，所得的實際水解度為（40.71±1.03）%，說明所建立的試驗模型能夠真實的反應4種因素對牡蠣蛋白酶解效果的影響，所得的酶解條件可靠穩定，對實際生產具有一定的指導作用。

3　結論

本研究以新鮮牡蠣為原料，采用水解蛋白酶與風味蛋白酶對牡蠣蛋白進行復合酶解，利用單因素試驗和響應面法對牡蠣蛋白酶解工藝參數進行優化，得出了牡蠣雙酶酶解的實際最佳工藝條件為復合酶中水解蛋白酶與風味蛋白酶的復配比例為2∶1（體積比），復合酶加酶量為0.70%、pH=6.87，酶解溫度58.6℃，酶解時間為3.4 h，在此條件下，新鮮牡蠣酶解后的水解度最高，為40.71%。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Oyster Protein Using Response Surface Methodology

WEN Zhi-zhou
（Foshan Haitian Flavouring and Food Co.，Ltd.，Foshan 528000，Guangdong，China）

In order to improve the utilization of oysters protein.Fresh oysters was used as raw material，The fresh oysters was hydrolyzed with proteolytic enzyme and flavourzyme.And then the Box-Behnken response surface method was used to optimize the combination of enzymatic hydrolysis process.Results showed that the best conditions for oysters proteolysis was the quantity of compound enzyme was 0.70%，pH 6.87，the enzyme hydrolysis temperature 58.6℃，the hydrolysis time was 3.4 h.Under this condition the hydrolysis degree was the highest，which was 40.71%.

oyster；enzymatic hydrolysis；response surface methodology；degree ofhydrolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.022

文志州（1978—），男（漢），工程師，本科，研究方向：食品調味料研發與管理。

2016-01-28