柱前衍生RP-HPLC法測定仙鶴草中氨基酸含量

趙巖，趙天琦，徐殿文，郜玉鋼，蔡恩博，劉雙利，楊鶴，張連學，*（.吉林農業大學中藥材學院，吉林長春308；.沈陽軍區洮南訓練場，吉林白城3700）

柱前衍生RP-HPLC法測定仙鶴草中氨基酸含量

趙巖1，趙天琦1，徐殿文2，郜玉鋼1，蔡恩博1，劉雙利1，楊鶴1，張連學1，*
（1.吉林農業大學中藥材學院，吉林長春130118；2.沈陽軍區洮南訓練場，吉林白城137100）

采用柱前衍生RP-HPLC法對仙鶴草中游離及水解氨基酸進行測定。以異硫氰酸苯酯為柱前衍生化試劑。以異硫氰酸苯酯為柱前衍生化試劑；色譜柱采用Ultimate Amino Acid氨基酸柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相A為80%（體積分數）的乙腈-水溶液，流動相B為7%（體積分數）的乙腈-CH3COONa溶液（pH=6.5）；檢測波長為254 nm。21種氨基酸在0.001 9μmol/mL～2.700μmol/mL內呈良好的線性關系（R2＞0.999 0）。21種游離氨基酸平均回收率在95.84%～ 111.34%之間，RSD在1.23%～2.54%之間（n=6）；水解氨基酸平均回收率在90.79%～111.23%之間，RSD在1.29%～ 2.21%之間（n=6）。柱前衍生RP-HPLC法靈敏、準確，具有良好的重復性和穩定性，適合仙鶴草中氨基酸含量測定。

仙鶴草；柱前衍生；氨基酸；高效液相色譜

仙鶴草（Agrimonia pilosa Ledeb.）為薔薇科多年生草本植物龍牙草的全草，異名脫力草、馬鞭草、龍牙草、石打穿等，始載于《滇南草本》。現代藥理研究證實，仙鶴草具有收斂止血、截疽、止痢、解毒等作用，主要用于咳血、吐血、崩漏下血、瘧疾、血痢、脫力勞傷、癰腫瘡毒、陰癢帶下等[1-4]。仙鶴草資源豐富，化學成分多樣，主要含有仙鶴草素、仙鶴草內酯、鞣質、甾醇、有機酸、酚性成分、皂苷、仙鶴草酚（A、B、C、D）、VC、VK等，但對仙鶴草中的游離氨基酸和水解氨基酸鮮見相關報道。氨基酸是構成蛋白質的基本單位，蛋白質是構成生命的基本物質，也是非常重要的營養物質。蛋白質能夠促進機體的新陳代謝，調節機體的生理機能，供應機體的所需能量，但是人體需要的22種氨基酸中，有9種氨基酸是機體不能自身合成或者合成量不夠的，這就需要從食物藥物中獲取。氨基酸測定方法有化學法、分光光度法[5]、色譜法（紙色譜、薄層色譜、氣相色譜和液相色譜）、電化學法[6]等，其中HPLC法應用最為廣泛。本試驗為仙鶴草建立了一種方法，先用HCl進行水解再用HPLC法測定游離氨基酸和水解氨基酸的含量，為仙鶴草在藥品和食品上的開發利用提供參考。

1　材料

1.1原料

仙鶴草采于吉林農業大學院內，經吉林農業大學張連學教授鑒定為仙鶴草 （Agrimonia pilosa Ldb.）的全草。

1.2儀器

FW-100型高速萬能粉碎機：北京中興偉業儀器有限公司；220V/50Hz超聲波清洗機：江蘇省昆山市超聲儀有限公司；2XZ-4型旋片式真空泵：上海博一泵業制造有限公司；HH-6B數顯恒溫水浴鍋：上海明橋精密科學儀器有限公司；CXTH-3000 HPLC色譜儀：北京創新通恒科技有限公司。

1.3試劑

21種氨基酸對照品（≥98%）：國藥集團化學試劑有限公司；三乙胺：天津市光復精細化工研究所；除乙腈為色譜純，其余試劑均為國產分析純。

2　方法與結果

2.1HPLC條件

Ultimate Amino Acid氨基酸色譜柱（5μm，4.6 mm× 250 mm），柱溫為35℃，UV檢測波長是254 nm。流動相A是80%（體積分數）的乙腈水溶液，B是7%（體積分數）的乙腈CH3COONa溶液（pH=6.5）。流速為1.0 mL/min。梯度洗脫：0～11 min，0%～6.5%A；11 min～13.9 min，6.5%～11%A；13.9 min～17 min，11%～ 13.4%A；17 min～29 min，13.4%～30%A；29 min～32 min，30%～70%A；32 min～35 min，70%～100%A；35 min～ 42 min，100%A；42 min～45 min，100%～0%A；45 min～ 60 min，0%A。

2.2溶液的制備[7]

2.2.1對照品溶液的制備

精密稱定21種氨基酸，包括天冬酰胺（Asn）、胱氨酸（Cys-Cys）、亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、賴氨酸（Lys）、甲硫氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、異亮氨酸（Ile）、丙氨酸（Ala）、蘇氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）、纈氨酸（Val）、絲氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）、色氨酸（Trp）、谷氨酰胺（Gln），加0.1 mol/L鹽酸溶解，配制除胱氨酸濃度為1.25μmol/mL外、其他氨基酸濃度為2.5μmol/mL的氨基酸混合對照品溶液，4℃保存，備用。

2.2.2衍生化試劑的制備

衍生化試劑A是20%（體積分數）的三乙胺乙腈溶液，衍生化試劑B是1/80（體積分數）的異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液，均為4℃保存。

2.3對照品溶液的衍生化

吸取氨基酸混合對照品溶液200μL，置于1.5 mL離心管中，加入衍生試劑A和B各100μL，搖勻，靜置1 h，加正己烷至800μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，0.45μm濾膜濾過，取20μL進行HPLC分析。

2.4供試品溶液的制備與衍生化

2.4.1游離氨基酸供試品溶液的制備與衍生化

稱取仙鶴草粉末0.500 0 g，加入50%乙醇溶液50 mL，超聲提取兩次，時間為30 min/次，合并濾液，濾液于80℃水浴揮至近干，蒸餾水溶解于10 mL量瓶中并定容至刻度。吸取1 mL提取液，加入衍生化試劑A100μL，衍生化試劑B100μL，搖勻，靜置1 h，加入正己烷400μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，0.45μm濾膜濾過，取20μL進行HPLC分析。

2.4.2水解氨基酸供試品溶液的制備

稱取仙鶴草粉末0.100 0 g，加入6 mol/L的鹽酸水溶液10 mL、1%的苯酚1 mL，抽取真空狀態，充足量的氮氣，重復3次，于110℃水解24 h，水解液至于50 mL量瓶中并用蒸餾水定容至刻度。吸取2 mL定容液于80℃水浴揮干，加入蒸餾水洗凈鹽酸。加入2 mL蒸餾水，超聲溶解。吸取1 mL提取液，加入衍生化試劑A100μL，衍生化試劑B100μL，搖勻，靜置1 h，加入正己烷400μL萃取，振搖后放置10 min，取下層溶液，0.45μm濾膜濾過，取20μL進行HPLC分析。

2.5線性關系考察[8]

取混合氨基酸對照品溶液，按“2.2.3”項下方法衍生后按照HPLC條件進樣，分析測定其峰面積，以各種氨基酸的濃度（x，μmol/mL）對各種氨基酸峰面積（y）進行線性回歸，得21種氨基酸的檢測濃度在0.001 9μmol/mL～2.700 0μmol/mL范圍內與各自峰面積呈良好的線性關系。21種氨基酸的線性回歸方程及R2值見表1。

表1　21種氨基酸線性回歸方程及線性相關系數Table 1　Linear regression equation and correlation coefficientof 21 kinds ofamino acids

2.6精密度試驗

吸取氨基酸混合對照品溶液1 mL，按2.3方法衍生后，連續進樣6次，分析測定氨基酸峰面積。結果是21種氨基酸峰面積的RSD在0.49%～0.93%之間（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.7穩定性試驗

吸取“2.4.1”項下供試品溶液1 mL，分別于0、1、2、4、6、8、12、24、36 h進樣，分析測定氨基酸峰面積。結果是21種氨基酸峰面積的RSD在0.21%～2.79%之間（n=9），表明供試品溶液在36 h內比較穩定。

2.8重復性試驗

稱取同一批仙鶴草粉末6份，按2.4.1和2.4.2方法制備供試品溶液后，按上述色譜條件進樣，分析測定氨基酸峰面積，計算氨基酸含量。結果是21種游離氨基酸百分含量的RSD在1.34%～2.14%之間（n=6），測定水解氨基酸的21種氨基酸百分含量的RSD在1.14%～2.44%之間（n=6），表明本方法重復性良好。

2.9加樣回收率試驗

2.9.1游離氨基酸的回收率試驗

稱取仙鶴草粉末0.250 0 g，加入氨基酸混合對照品適量，按游離氨基酸檢測方法分別提取、衍生、進樣，重復6次，計算游離氨基酸的回收率。結果是21種游離氨基酸的平均回收率在95.84%～111.34%之間，RSD在1.23%～2.54%之間（n=6）。

2.9.2水解氨基酸的回收率試驗

稱取仙鶴草粉末0.050 0 g，加入氨基酸混合對照品適量，按水解氨基酸檢測方法分別提取、衍生、進樣，平行6次，計算水解氨基酸的回收率。結果是21種水解氨基酸的平均回收率在90.79%～111.23%之間，RSD在1.29%～2.21%之間（n=6）。

2.10樣品測定的結果

稱取仙鶴草樣品，按上述方法處理，分析測定，計算其游離氨基酸和水解氨基酸含量。仙鶴草中21種氨基酸含量見表2。色譜圖見圖1。

表2　仙鶴草中游離氨基酸和水解氨基酸含量Table 2　Species andcontents of the free amino acids and hydrolyzed amino acids in Agrimonia pilosa Ldb.　mg/g

3　結論與討論

本研究氨基酸提取水解時用的HCl的濃度很重要，低濃度HCl促進色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的水解，但其余氨基酸水解的含量偏低，高濃度的HCl會解離部分氨基酸。所以分別用1、3、6、12 mol/L的鹽酸進行水解，結果表明，當HCl濃度為6 mol/L時，大部分氨基酸水解效果最好。因此，確定HCl水解的最適濃度為6 mol/L。

分別考察C18色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）、C18色譜柱（5μm，4.6 mm×150 mm）、C18色譜柱（5μm，4.6 mm× 250 mm）、Ultimate Amino Acid氨基酸色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）對21種氨基酸的分離效果，結果UltimateAminoAcid氨基酸色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）的分離效果最好。正己烷可以降低剩余的衍生試劑對色譜柱的損傷，此外在色譜柱前端加上保護柱，可以減輕試劑對色譜柱的損傷，延長色譜柱的使用時間。

從圖1和表2可以看出，仙鶴草游離氨基酸測定結果中含有的21種游離氨基酸。其中，天冬酰胺、精氨酸與谷氨酰胺含量較高，分別為16.452、13.968、5.203 mg/g。由于游離氨基酸可直接被吸收，所以測定仙鶴草中游離氨基酸的含量是非常必要的。但是某些蛋白質難溶于水，在體內不能被水解成氨基酸后，導致其利用率降低。經酸水解后，仙鶴草中氨基酸含量提高了9.021 mg/g，其中提高最多的是天冬氨酸，含量高達22.536 mg/g。天冬氨酸大量存在于生物合成作用中，它是生物體內多種人體必需氨基酸的合成前體。其中，8種人體必需氨基酸除色氨酸外，其余氨基酸含量較游離氨基酸都明顯升高，苯丙氨酸含量達3.416 mg/g。苯丙氨酸作為人體必需氨基酸在人體內不能合成，只能靠植物和微生物合成，廣泛應用于食品、醫療和化工行業[9]。半必需氨基酸中精氨酸、組氨酸含量分別為16.274、0.704 mg/g。臨床研究證明，精氨酸有促進傷口愈合、調節細胞免疫、抗腫瘤等方面的作用[10-13]，臨床應用與冠心病、心衰和高血壓等疾病[14]。在酸水解過程中有3種氨基酸在水解后含量減少，原因可能是色氨酸結構被破壞，天冬酰胺和谷氨酰胺發生脫酰胺基反應，這也是本方法需要進一步完善的原因。

綜上所述，本文建立了異氰酸苯酯（PITC）柱前衍生同時HPLC法分離并測定仙鶴草中游離氨基酸及水解氨基酸的分析方法。該方法簡便、快捷、高效，具有較高的穩定性，可用于工業生產，為仙鶴草中蛋白質及氨基酸資源的深入開發提供了理論參考。

圖1　仙鶴草氨基酸高效液相色譜圖Fig.1　Agrimonia pilosa Ledeb.amino acid HPLC

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Content Determination of Amino Acid in Agrimonia pilosa Ledeb.by Precolumn Derivatization RPHPLC

ZHAO Yan1，ZHAO Tian-qi1，XU Dian-wen2，GAO Yu-gang1，CAIEn-bo1，LIU Shuang-li1，YANG He1，ZHANG Lian-xue1，*
（1.College of Chinese Medicinal Materials，Jilin AgriculturalUniversity，Changchun 130118，Jilin，China；2.Shenyang Military Taonan Training Field，Baicheng 137100，Jilin，China）

To determine the content amino acid in Agrimonia pilosa Ledeb.by pre-column derivatization RPHPLC.The samples were derived with phenylisothiocy anate（PITC）.The column was Ultimate Amino Acid of specific column（4.6 mm×250 mm，5μm）；Mobile phase：A was mixture ofacetonitrile-water（80%，volume fraction），B was a buffer solution ofCH3COONa（pH6.5）-acetonitrile（7%，volume fraction），eluting with a gradi ent.UV wavelength was setat254 nm.The linearrange of21 amino acids was 0.001 9μmol/mL-2.700 0μmol/mL （R2>0.999 0）；the average recovery rates of21 free amino were ranged from 95.84%to 111.34%（RSD=1.23%-2.54%，n=6），the average recovery ofrates of21 totalamino acids was ranged from 90.79%to 111.23%（RSD= 1.29%-2.21%，n=6）.This method was flexible，accurate and repeatable and stable for the determination of amino acids in Agrimonia pilosa Ledeb..

Agrimonia pilosa Ledeb.；precolumn derivatization；amino acid；high performance liquid chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.027

國家科技支撐計劃項目（2011BAI03B01）；國家公益性行業科研專項（201303111）；科技部科技人員服務企業項目（2009GJB10031）；吉林省科技發展計劃項目（20130303094；20140204013YY；YYZX201258；20140311050YY）

趙巖（1979—），男（滿），副教授，碩士生導師，博士，研究方向：天然藥物化學成分與生物活性。

張連學（1955—），男，教授，博士，研究方向：藥用植物栽培與加工。

2015-04-11