熒光免疫層析檢測牛奶中的生物素含量

劉海英（內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特010070）

熒光免疫層析檢測牛奶中的生物素含量

劉海英
（內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特010070）

以熒光微球作為新型標(biāo)記物，采用EDC/NHS兩步法偶聯(lián)，制備熒光微球鏈霉親合素復(fù)合物。復(fù)合物顆粒均一、性質(zhì)穩(wěn)定。以其作為探針，建立檢測牛奶中生物素含量的熒光免疫層析法。本方法特異性良好，最低檢出限低至3 ng/mL，線性范圍5 ng/mL～100 ng/mL，回收率90%～110%，精密度CV＜10%；與微生物法對比，測值相關(guān)系數(shù)為0.975。

熒光微球；探針；最低檢出限

生物素，又稱維生素H，是一種水溶性B族維生素，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、生物學(xué)、飼料添加劑以及食品等方面。另外，生物素在保健品制劑以及發(fā)酵工業(yè)中，也得到了廣泛的應(yīng)用[1]。生物素是乙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酰CoA羧化酶和3-甲基巴豆酰CoA羧化酶4種羧化酶輔酶成分[2]。生物素對動(dòng)物體基因的表達(dá)、蛋白的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要的意義[3]；參與機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)[4]等。

食品中生物素的檢測，以往文獻(xiàn)報(bào)道方法主要包括微生物法[5-6]、高效液相法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]等，但這些方法存在操作繁瑣、或準(zhǔn)確度不高、或靈敏度較差、或儀器要求較高等缺點(diǎn)。

熒光微球是一種受激發(fā)光源激發(fā)能發(fā)出熒光的固體微粒，通常的制備方法是將熒光染料通過物理或化學(xué)方法吸附或包埋到粒子內(nèi)，其直徑一般在0.01μm～ 10μm范圍內(nèi)。得益于熒光微球的發(fā)光強(qiáng)度隨著激發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng)，熒光微球標(biāo)記能夠提高免疫層析技術(shù)的檢測限。熒光微球的表面電荷的互相作用，使其形態(tài)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，粒度均一性高、單分散性好、發(fā)光效率高以及具有有較好的生物相容性[9]。微球形成后其熒光猝滅大大減少，不受外界環(huán)境介質(zhì)變化的影響[10]，熒光強(qiáng)度高而穩(wěn)定。因此，以熒光微球作為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)具有較高的研究價(jià)值與技術(shù)前景。基于此，本研究采用熒光微球作為標(biāo)記物，建立一種快速檢測牛奶中生物素含量的方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原材料與試劑

生物素：sigma公司；鏈霉親合素：艾美捷科技有限公司；抗鏈霉親和素抗體：上海寶曼生物科技有限公司；生物素-BSA抗原：上海瑞齊生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）：AMRESCO公司；NC膜：Millipore公司；熒光微球：Invitrogen公司；EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽）、NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）：阿拉丁試劑。

1.1.2儀器與設(shè)備

BIO DOT XYZ3050點(diǎn)噴系統(tǒng)：美國BIO DOT公司；HGS510全數(shù)字化的高速斬切機(jī)：杭州峰航科技有限公司；Sorvall RC-6 Plus冷凍離心機(jī)：Thermo Scientific公司；DHG-9140（A）干燥箱：金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；MS2000粒度分析儀器：英國馬爾文儀器有限公司；Microdetection熒光讀數(shù)儀：南京微測生物科技有限公司。

1.2熒光微球免疫層析方法的建立[11]

1.2.1熒光微球標(biāo)記鏈霉親合素

膠乳微球0.2 mL，加入50 mmol/L的MES緩沖液4.8 mL，混勻加入與熒光微球表面羧基含量等摩爾量的EDC與NHS，37℃反應(yīng)30 min，分別緩慢加入鏈霉親合素50、75、100μg，4℃緩慢攪拌過夜，4℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清，用5 mL含1%BSA的pH=7.4的PBST緩沖液重懸，超聲3 min，37℃攪拌2 h，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取偶聯(lián)前的熒光微球與偶聯(lián)后的熒光微球，用粒度分析儀器分析其zata電位、平均粒度直徑以及多分散性指數(shù)（PDI）。

1.2.2熒光微球結(jié)合墊制備

取1.2.1所得到的3種不同鏈霉親合素濃度標(biāo)記的熒光微球，以10μL/cm的噴涂量用點(diǎn)噴系統(tǒng)噴涂到結(jié)合墊上，在30℃的干燥箱中干燥4 h，得到3種標(biāo)記濃度的結(jié)合墊，干燥備用。

1.2.3NC膜處理與制備

將生物素-BSA抗原以及抗鏈霉親和素抗體分別于NC膜的適當(dāng)位置用點(diǎn)噴系統(tǒng)進(jìn)行劃線，得到T線（檢測線）與C線（質(zhì)控線）。在30℃的干燥箱中干燥2 h，備用。將上述NC膜分別浸入1%BSA、1%OVA中進(jìn)行封閉30 min，然后洗滌干凈，30℃的干燥箱中干燥2 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4試紙條組裝

在干燥環(huán)境中，按照樣品墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊的順序，取1.2.2所得到的3種不同濃度的結(jié)合墊與1.2.3所得到的未封閉、BSA封閉、OVA封閉的NC膜，依次黏貼于PVC墊板上。用高速斬切機(jī)切成4 mm寬的試紙條，組裝上外殼，真空包裝機(jī)干燥保存。

將組裝好的試紙條分別加入濃度為0、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，用免疫熒光分析儀讀數(shù)，得到T線與C線的峰面積（peak area，PA），計(jì)算PA0ng/mL/PA100ng/mL。

1.3熒光微球免疫層析方法的評價(jià)

1.3.1最低檢測限

以濃度為0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定20次，計(jì)算PA均值x與標(biāo)準(zhǔn)差s，以x-2s作為最低檢測限，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出對應(yīng)濃度。

1.3.2線性范圍

以一定濃度的樣品進(jìn)行稀釋，至少5個(gè)梯度（xi），用試紙條進(jìn)行測試，每個(gè)測試3次重復(fù)，分別求出測定結(jié)果的均值（yi）。以稀釋濃度（xi）為自變量，以測定結(jié)果均值（yi）為因變量求出線性回歸方程。按公式（1）計(jì)算線性回歸的相關(guān)系數(shù)r。

用稀釋濃度（xi）代入求出線性回歸方程，計(jì)算yi的估計(jì)值，及yi與估計(jì)值的相對偏差或絕對偏差。

1.3.3準(zhǔn)確度[12]

采用回收試驗(yàn)，在樣品中加入一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積不會產(chǎn)生基質(zhì)的變化，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液然后濃度依然在線性范圍之內(nèi)），每個(gè)濃度重復(fù)測定3次，按公式2計(jì)算回收率R。

式中：R為回收率，%；V為加入標(biāo)準(zhǔn)品的體積，mL；V0為樣品體積，mL；C為樣品加入標(biāo)準(zhǔn)品后的測定濃度，ng/mL；C0為樣品的測定濃度，ng/mL；CS為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，ng/mL。

1.3.4精密度

定標(biāo)后平行測試高值與低值樣本各10次，計(jì)算測定均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），按照公式（3）計(jì)算變異系數(shù)。

1.3.5特異性

特異性可用交叉反應(yīng)率來表示。交叉反應(yīng)率即引起50%抑制的生物素標(biāo)準(zhǔn)物濃度（生物素IC50）與引起50%抑制的生物素類似物濃度（生物素相似物IC50）值之比。本試驗(yàn)測定該方法與葉酸、VB12、VB1、VB2、VC等的交叉反應(yīng)率。

1.3.6測值相關(guān)性

本方法與對照方法（微生物法）同步檢測50例樣本，分析兩者測值相關(guān)性。

1.3.7牛奶樣本生物素本底測定

用本法檢測市售樣本中生物素含量，并分析其分布規(guī)律、趨勢。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用origin 8.0進(jìn)行作圖與數(shù)據(jù)的分析，以α=0.05作為差異顯著性水平。

2　結(jié)果與分析

2.1偶聯(lián)前后熒光微球的表征

采用粒度分析儀器分析膠乳微球在偶聯(lián)鏈霉親合素前、后的粒徑及zata電位的變化，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1　偶聯(lián)前后熒光微球粒徑變化Fig.1　The change in particle size before and after coupling

圖2　偶聯(lián)前后熒光微球zata電位變化Fig.2　The change in zata potentialbefore and after coupling

由圖1可知偶聯(lián)前熒光微球的平均直徑為95.33nm，偶聯(lián)之后熒光微球的平均直徑增加到112.25 nm。由圖2可知，偶聯(lián)前、后的熒光微球均帶有負(fù)電荷，其zata電荷強(qiáng)度分別為-44.8、-32.9 mV，并且其電位的強(qiáng)度相對時(shí)間均保持穩(wěn)定狀態(tài)。熒光微球偶聯(lián)鏈霉親合素前多分散性指數(shù)（PDI）為0.024，偶聯(lián)之后PDI為0.045。zata電荷強(qiáng)度與PDI數(shù)據(jù)表征所用的熒光微球在偶聯(lián)前、后均顆粒均一、性質(zhì)穩(wěn)定；微球粒徑數(shù)據(jù)表征偶聯(lián)之后粒徑增加，蛋白偶聯(lián)成功。

2.2偶聯(lián)熒光微球及NC膜封閉工藝參數(shù)的篩選結(jié)果

本方法基于樣本中的生物素與結(jié)合于NC膜T線的生物素競爭結(jié)合熒光微球上偶聯(lián)的鏈霉親合素（抗生物素蛋白）。鏈霉親合素偶聯(lián)量的高低影響著試紙條的性能指標(biāo)。NC膜是多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)膜，生物大分子及較大顆粒在NC膜上層析過程中可能與膜發(fā)生非特異性吸附[11]。因此采用封閉劑進(jìn)行NC膜的封閉是降低這種非特異性吸附的有效手段，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了50、75、100μg 3種蛋白偶聯(lián)量以及未封閉NC膜、BSA封閉、OVA封閉3種不同的NC膜處理方式共9組試驗(yàn)驗(yàn)證蛋白偶聯(lián)量及封閉工藝對熒光微球在NC膜上涌動(dòng)性能的影響，見表1。

表1　不同的偶聯(lián)及封閉工藝的試驗(yàn)結(jié)果Table 1　The results ofdifferentcoupling and blocking crafts

由表1可以看出，當(dāng)封閉工藝一致時(shí)，隨著偶聯(lián)蛋白濃度的提高，PA0ng/mL與PA100ng/mL均呈現(xiàn)升高的趨勢；當(dāng)偶聯(lián)蛋白濃度一致時(shí)，PA0ng/mL與PA100ng/mL高低順序依次為未封閉≥1%OVA封閉≥1%BSA封閉；當(dāng)?shù)鞍着悸?lián)量為75μg，采用1%OVA進(jìn)行封閉時(shí)，試紙條檢測100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品具有最低的PA值（非特異性反應(yīng)最低）且具有最高的N/P（PA0ng/mL/PA100ng/mL=28.33）。因此選擇蛋白偶聯(lián)量75μg，采用1%OVA進(jìn)行NC膜封閉工藝。

2.3熒光微球免疫層析方法的性能評價(jià)結(jié)果

2.3.1定標(biāo)曲線

熒光微球免疫層析方法的定標(biāo)曲線見圖3。

圖3　熒光微球免疫層析方法的定標(biāo)曲線Fig.3　The calibration curve of the immunofluorescence chromatography method

以生物素濃度為自變量，以熒光強(qiáng)度（PA）為因變量，采用指數(shù)擬合得到擬合曲線函數(shù)為y=-6 284.5+ 1 218 420×e-0.03006x，r=0.998，P＜0.05，擬合曲線良好。

2.3.2最低檢出限與線性范圍

0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定20次，得到的PA均值x=1 225 000，標(biāo)準(zhǔn)差s=59 600，x-2s=1 107 000，代入2.3.1所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出對應(yīng)的生物素濃度為3 ng/mL，即為最低檢出限。

線性范圍測定結(jié)果見圖4。

圖4　熒光微球免疫層析方法線性范圍測定結(jié)果Fig.4　The linear range of the immunofluorescence chromatography method

由圖4可以得出，本方法在5 ng/mL～100 ng/mL范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 48，線性相關(guān)性良好。

2.3.3準(zhǔn)確度

選取5組樣品進(jìn)行回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　熒光微球免疫層析方法回收試驗(yàn)測定結(jié)果Table 2　The recovery test results ofthe immunofluorescence chromatography method

由表2可知，5組樣品回收率均在90%～110%之間，準(zhǔn)確度良好。

2.3.4精密度與特異性

采用高低值兩樣本重復(fù)測定10次，高值樣本與低值樣本CV≤10%（低值樣本：CV=3.65%；高值樣本：CV=1.17%）。熒光微球免疫層析方法特異性測定結(jié)果見表3。

表3　熒光微球免疫層析方法特異性測定結(jié)果Table 3　The specificity test results of the immunofluorescence chromatography method

由表3可以看出，本方法與葉酸、VB12、VB1、VB2、VC的交叉反應(yīng)率均＜0.1%，特異性良好。

2.3.5測值相關(guān)性

與對照方法同步檢測50例樣本，分析結(jié)果見圖5。

圖5　熒光微球免疫層析方法與比對方法測值相關(guān)性分析Fig.5　The correlation analysis between the immunofluorescence chromatography method and the comparison method

由圖5可知，本研究方法與比對方法相關(guān)曲線為y=0.986 6x-0.250 8，相關(guān)系數(shù)r2=0.950 11，測值相關(guān)性良好。

2.3.6市售牛奶樣品生物素本底測定

用本法進(jìn)行100例市售牛奶樣本生物素含量檢測，其含量范圍為7.5 ng/mL～51.0 ng/mL，均值29.3 ng/mL，中位數(shù)29.6 ng/mL，100例牛奶樣品中生物素測定結(jié)果見圖6。

圖6　100例牛奶樣品中生物素測定結(jié)果Fig.6　The biotin concentration of100 milk samples

由圖6可知，生物素濃度在25 ng/mL～35 ng/mL的樣品具有最高的頻數(shù)（共43例），生物素濃度超過50 ng/mL的樣品數(shù)量極少（2例），生物素濃度低于10 ng/mL的樣品僅1例。

3　討論

在生物素的測定方法中，微生物法是最為靈敏和應(yīng)用最為廣泛的，主要用于生物素的微量檢測。其原理是在一定條件下，生物素的濃度與菌體的生長量及生長速度呈線性關(guān)系。微生物法是GB/T 5413-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒配方食品和乳粉游離生物素的測定》[13]仲裁法，也是現(xiàn)今美國政府機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室和FDA一直在用的方法。但由于其檢驗(yàn)周期長，操作較復(fù)雜，試驗(yàn)工作量大，對人員技術(shù)要求較高，從而難以推廣。殷曉紅等[14]用該法測定嬰兒配方食品中生物素含量，方法重現(xiàn)性好，變異系數(shù)為3.34%，平均回收率為97%，回收范圍為88.5%～110.0%。

近年來，HPLC法應(yīng)用于生物素的測定的報(bào)道較多。肖晶等[7]用HPLC法測定保健食品中的生物素，檢出極限為0.5 mg/kg，回收率在87%～102%之間。鄧富良等[15]用HPLC測定注射用水溶性維生素中的生物素，檢測限為0.5 ng（20μL），線性范圍為0.25μg/mL～25.14μg/mL，平均回收率在99.35%以上。HPLC法測定生物素，簡便、快速、靈敏度高、重復(fù)性好、適應(yīng)性好，但對某些成分復(fù)雜、色素較多、雜質(zhì)干擾大的樣品，不宜用該法檢測。

本研究對生物素含量的檢測采用熒光微球免疫層析方法。熒光微球等發(fā)射光譜型標(biāo)記物因信號強(qiáng)度可隨激發(fā)光增強(qiáng)而增強(qiáng)，因此可以有效降低層析方法的檢測限。本試驗(yàn)以EDC/NHS介導(dǎo)的兩步法偶聯(lián)合成了適用于免疫層析檢測的熒光微球探針。熒光微球探針粒度均一、化學(xué)及光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。以此建立的以生物素為目的物的免疫層析檢測方法，最終檢測限可達(dá)3 ng/mL，靈敏度高于微生物法及HPLC法。

本研究采用競爭法。結(jié)合于NC膜T線的生物素與待測樣品或者標(biāo)準(zhǔn)品中的生物素競爭結(jié)合熒光微球標(biāo)記的鏈霉親合素，生物素含量的高低與熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱成反比。由于鏈霉親合素僅特異性的親和生物素，因此與樣品中的其它生物素類似物如葉酸、VB12VB1、VB2、VC均無非特異性的交叉反應(yīng)，從而保證了生物素含量的準(zhǔn)確測定。

本研究采集了市售的50例牛奶樣本，同時(shí)采用本方法與微生物方法進(jìn)行測值相關(guān)性分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法與微生物方法具有良好的線性相關(guān)性。另外，收集市售100例樣品進(jìn)行樣品濃度的測定發(fā)現(xiàn)，生物素含量范圍為7.5 ng/mL～51.0 ng/mL，含量均值29.3 ng/mL，這與劉志楠等[16]的研究結(jié)果具有一致性。

本研究的創(chuàng)新性在于采用熒光微球免疫層析方法，有效的降低了生物素檢出限，極大地縮短了樣品測定的時(shí)間，另外采用基于生物素鏈霉親合素特異性結(jié)合的競爭法，有效的降低生物素類似物的非特異性反應(yīng)。本方法有利于乳品企業(yè)快速的檢測牛奶中生物素的本底含量，指導(dǎo)進(jìn)行生物素的合理添加。

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Immunofluorescence Chromatography for Detecting Biotin in Milk

LIU Hai-ying
（Food Engineering Departmentof Inner Mongolia Business&Trade VocationalCollege，Hohhot010070，Inner Mongolia，China）

A composition with a character and uniform size which contained fluorescentmicrospheres as a novel lable was obtained by an EDC/NHS two-step method.The biotin in milk was detected by the immunofluorescence chromatography which had this compositoin as a probe.The method showed good specificity with the detection limitof3 ng/mL，the linear range of 5 ng/mL-100 ng/mL，the recovery of90%-110%and the precision CV less than10%；the correlation coefficient of measuring value was 0.975 compared with microbiological method.

fluorescentmicrospheres；probe；detection limit

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.032

劉海英（1981—），女（蒙古），講師，碩士研究生，研究方向：食品加工技術(shù)。

2016-03-04