雙葉顆粒質量標準的研究

王蓮，王嵐，楊博涵，龐文悅，張榮泉（天津市醫藥科學研究所，天津300020）

雙葉顆粒質量標準的研究

王蓮，王嵐，楊博涵，龐文悅，張榮泉*
（天津市醫藥科學研究所，天津300020）

建立功能食品雙葉顆粒的質量控制方法。采用紫外分光光度法測定雙葉顆粒中總黃酮含量，并對其方法學進行考察；同時對其理化和微生物指標進行檢測。總黃酮含量在0.00～45.60μg/mL濃度范圍內線性關系良好，r=0.999 7，平均加樣回收率為98.92%，RSD為1.43%。

雙葉顆粒；柿葉；山楂葉；質量標準

柿葉系柿樹科（Ebenaceae）柿樹屬（Diospyros）植物柿（Diospyros kaki L.f.）的新鮮或干燥葉子，具有清熱解毒、潤肺強心、鎮咳止血、抗癌防癌等多種醫療保健功能[1]；山楂葉系薔薇科植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥葉，能夠消食健胃、行氣散瘀[2]。二者均含有豐富的黃酮類化合物，可有效調節體內脂代謝功能，保護心腦血管系統。目前，柿葉與山楂葉已被列入到國家食品藥品監督管理局保健食品原料名稱目錄征求意見稿當中，其保健價值及經濟價值得到了社會與專家的廣泛認可。

我國是世界上最主要的柿樹及山楂樹生產國，柿葉和山楂葉資源十分豐富。但是長期以來，人們對葉片資源不夠重視，致使這一保健資源被一再忽視。雙葉顆粒就是以柿葉和山楂葉提取物為主要原料，研發制備出的能夠有效調節體內脂代謝的功能食品。為了能夠更為有效準確地控制制劑的內在質量，本文擬建立操作簡便、結果準確、重復性好的總黃酮含量控制方法，并對其理化指標和微生物指標進行考察，從而建立一個準確、可靠、專屬性強的產品質量標準。

1　材料與儀器

1.1材料與試劑

原料：柿葉與山楂葉均產自天津市薊縣黃崖關，經鑒定為柿科植物柿的干燥葉及薔薇科植物山楂的干燥葉，自然晾干。

微晶纖維素：遼寧奧達制藥有限公司；乳糖：DAVISCO FOODS INTERNATIONAL.INC；玉米淀粉：河北海玉食品有限責任公司；糊精：遼寧奧達制藥有限公司；砂糖：廣東恒福糖業集團有限公司，粉碎，過100目篩網。

甲醇（優級純），無水乙醇、苯、石油醚均為分析純：天津市化學試劑批發公司；聚酰胺粉（100目～200目）：江蘇長豐化工有限公司；蘆丁標準品（10080-200707）：中國藥品生物制品鑒定所。

1.2儀器與設備

SPECORD 210 PLUS紫外可見光分光光度計：德國耶拿；AFS-933原子熒光光度計：北京吉天儀器有限公司；nov400P原子吸收分光光度計：德國耶拿；MD7微波消解儀：美城；AB204-E電子天平（精確值0.000 1 g）：METTLER TOLEDO；KQ-100超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DL-203B電熱干燥箱：天津實驗儀器廠；LDZ5-2低速自動平衡離心機：北京京立離心機有限公司；DL-Ⅰ-15臺式封閉電爐：天津市泰斯特儀器有限公司；SHH.W21.CR420恒溫水浴鍋：北京長安科學儀器廠；2B型干燥箱：南京長江制藥機械設備廠；YK160A型搖擺式制粒機、CH200A槽式混合機：江蘇常州市雙東制藥機械廠。

2　試驗方法

2.1雙葉顆粒的制備

將采集得到的柿葉、山楂葉分別干燥粉碎為粗粉，用適當溶劑進行煎煮提取，提取液濃縮為浸膏，加入規定濃度與用量的潤濕劑，攪拌制軟材，14目篩網制粒，60℃干燥后14目篩網整粒，并用80目篩網篩除細粉，備用。

2.2總黃酮含量質量控制

柿葉和山楂葉中含有豐富的黃酮類化合物，文獻報道其可有效調節體內脂代謝功能，故本文將總黃酮含量作為該顆粒質量控制的重要標志成分，并對其含量檢測方法進行方法學研究。

2.2.1溶液制備

2.2.1.1對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品約20.0 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL，得蘆丁對照品溶液。

2.2.1.2供試品溶液的制備

精密稱取供試品約1.0 g，置索氏提取器中，加入石油醚加熱回流提取至提取液無色，棄去石油醚液，樣渣揮去石油醚，轉移至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷至室溫，用甲醇補足重量，搖勻，離心，取上清液為供試品溶液。

2.2.2全波長掃描

取蘆丁對照品溶液進行顯色，以試劑為空白，用紫外分光光度儀在190 nm～700 nm范圍內進行全波長掃描，選擇最佳測定吸收波長。

2.2.3線性關系考察

精密吸取蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL量瓶中，加水至6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，加水至刻度，放置15 min，以0.0 mL對照品溶液制得的溶液作為空白，于波長510 nm比色測定，進行線性關系考察，計算回歸方程。

2.2.4精密度

取蘆丁對照品溶液連續比色6次，計算測定結果的RSD值。

2.2.5穩定性

取供試品溶液，分別于0、10、20、30、40、50、60 min在波長510 nm處進行比色測定，記錄不同時間測定的吸光度，計算RSD值。

2.2.6重復性

精密稱取約1.0 g的雙葉顆粒試樣6份，按照2.2.1.2項制成供試品溶液，于波長510 nm處比色測定，分別計算各試樣的總黃酮含量和RSD值。

2.2.7回收率

精密稱取約0.6 g的雙葉顆粒試樣9份，分別加入一定量的對照品溶液，按照2.2.1.2項制成供試品溶液，于波長510 nm處比色測定，計算其總黃酮含量和RSD值。

2.2.8供試品測定

分別精密稱取3批雙葉顆粒（批號為：201401，201402，201403）約1.0 g，按照2.2.1.2項進行供試品前處理，并于波長510 nm處比色測定，計算總黃酮含量。

2.3感官指標

取少量雙葉顆粒樣品，在自然光下肉眼觀察其組織形態、色澤、雜質等情況，嗅其氣味，品其滋味。

2.4理化指標測定

為進一步完善該顆粒劑產品的質量標準，在建立了總黃酮含量檢測方法的基礎上，依據食品國家標準（GB 5009.3-2010《食品安全國家標準食品中水分的測定》、GB 5009.4-2010《食品安全國家標準食品中灰分的測定》、GB 5009.11-2014《食品安全國家標準食品中總砷及無機砷的測定》、GB 5009.17-2014《食品安全國家標準食品中總汞及有機汞的測定》、GB 5009.12-2010《食品安全國家標準食品中鉛的測定》、GB 5009.15-2014《食品安全國家標準食品中鎘的測定》）及中國藥典相關標準[3]對成品顆粒的水分、灰分、總砷、總汞、鉛、鎘、溶化性等理化指標進行檢測。

2.5微生物指標測定

按照國家食品衛生微生物學檢驗的相關標準（GB 4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》、GB 4789.3-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》、GB 4789.15-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》、GB 4789.10-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》、GB 4789.4-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》），對其微生物常規檢測項目（菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母）和致病菌（金黃色葡萄球菌、沙門氏菌）進行了微生物檢測，為最終質量標準的制定提供了依據。

3　試驗結果

3.1總黃酮含量質量控制

3.1.1全波長掃描

全波長掃描結果發現蘆丁對照品溶液在波長510 nm處存在最大吸收（圖1），與參考文獻[4]報道一致，故選擇510 nm作為檢測波長。

圖1　蘆丁全波長掃描圖Fig.1　The fullwavelength scan ofrutin

3.1.2線性關系考察

以吸光度（A）為縱坐標，蘆丁對照品溶液濃度（μg/mL）為橫坐標繪制蘆丁標準曲線（圖2），線性回歸方程為Y=0.012 8X－0.005 3（r=0.999 7）。結果表明，蘆丁試樣在0.00～45.60μg/mL濃度范圍內與吸光度線性關系良好。

圖2　蘆丁標準曲線圖Fig.2　The standard curve ofrutin

3.1.3精密度

以蘆丁對照品溶液連續檢測6次，測定吸光度值，計算總黃酮的RSD為0.04%，結果表明儀器精密度良好。

3.1.4穩定性

取同一供試品溶液，分別于顯色后0、10、20、30、 40、50、60 min測定吸光度，吸光度值未出現明顯降低，RSD為0.23%，檢測方法穩定性良好。

3.1.5重復性

將制備得到的6份供試品溶液分別顯色，測定吸光度值，計算總黃酮含量，RSD為1.83%，表明重復性良好。

3.1.6回收率

將9份供試品溶液進行顯色測定，總黃酮加標回收率在97.39%-102.27%之間，RSD為1.43%，結果見表1。

表1　回收率測定結果Table 1　The results ofthe recovery detection

3.1.7供試品總黃酮含量測定

對3批雙葉顆粒試樣分別進行比色測定，根據回歸方程計算總黃酮含量，結果見表2，3批產品總黃酮含量未有顯著性差異，質量穩定。

表2　供試品測定結果Table 2　The results oftotalflavonoids detected

3.2感官指標

雙葉顆粒產品為黃棕色顆粒，色澤均勻，無異味，無肉眼可見的外來雜質。

3.3理化指標測定

按照試驗確定工藝參數，生產雙葉顆粒產品，其理化指標檢測結果見表3，污染物以及重金屬限量測定結果含量較低，符合（GB 16740-2014《食品安全國家標準保健食品》）中的相關規定，確保了產品的安全性。

表3　產品理化指標檢測結果Table 3　The results of physicaland chemicalindicators detected

3.4微生物指標測定

按照食品安全國家標準檢測雙葉顆粒中微生物指標，檢測結果見表4，各項檢測結果均符合國家保健食品微生物限度要求，表明產品衛生質量良好。

表4　產品微生物指標檢測結果Table 4　The results ofmicrobialindicators detected

4　結論與討論

1）試樣經預處理除雜后，以甲醇超聲提取黃酮類成分。該類成分被亞硝酸鈉還原，與硝酸鋁形成絡合物，在氫氧化鈉溶液堿性條件下開環，生成2-羥基查爾酮而使溶液顯特征橙紅色，在510 nm處有最大吸收，且呈色穩定，通過紫外分光光度計測定其吸光度，計算總黃酮含量。

2）本文采用紫外分光光度法測定雙葉顆粒中的總黃酮含量，其含量在0.00～45.60μg/mL濃度范圍內線性關系良好，r=0.999 7，平均加標回收率為98.9%，RSD為1.43%。試驗結果表明，該測定方法操作簡便、結果準確、重復性好，可有效控制中間體顆粒及成品的質量。

3）總黃酮提取溶劑的選擇：目前總黃酮提取方法多采用水提法與醇提法，水提法成本低、操作性強但提取率較低，多用于工業生產原料提取；醇提法提取率高、提取雜質少，更適于樣品含量檢測前處理。針對醇提法，本試驗進一步比較了甲醇與乙醇的樣品總黃酮提取效果，多次試驗結果表明甲醇的總黃酮提取率是乙醇的10倍左右，故選擇甲醇作為總黃酮含量測定的提取溶劑。

4）根據《保健食品檢驗與評價技術規范》要求，在總黃酮含量測定過程中，樣品前處理采用先超聲提取，再轉入層析柱進行洗脫的方法，結果顯示總黃酮樣品回收率偏低，處理過程中有可能存在總黃酮收集洗脫段不準確，總黃酮出現損失的問題，此法是否適于雙葉顆粒成品的檢測值得商榷。因此，本文對成品中總黃酮的提取和檢測方法進行了改進和優化，考察并驗證了相關的方法學，其結果良好。

5）柿葉和山楂葉為葉片型原料，葉綠素等雜質成分含量較高，對總黃酮顯色測定具有較大的影響[5]，故樣品除雜步驟是必要的。目前，除雜試劑多采用苯、甲苯、石油醚等，經試驗比較，其對總黃酮檢測結果未有顯著性影響，且苯類試劑具有一定毒性，故采用石油醚作為除雜試劑進行索氏提取，該操作過程相對復雜，對操作者的實驗技能要求較高，故重復性試驗的相對標準偏差稍高（RSD=1.83%），但樣品回收率試驗結果表明，樣品的前處理對總黃酮含量測定結果的準確度影響不大。

[1] 王燕.柿葉中黃酮類化合物的研究進展[J].亞太傳統醫藥,2011,7 (4):173-174

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部.[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015:32

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:四部.[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015:8

[4]白鴻.保健食品功效成分檢測方法[M].北京:中國中醫藥出版社, 2011:122-124

[5] 王蓮,米沙,龐文悅,等.比色法測定柿葉中總黃酮的含量[J].食品研究與開發,2012,33(6):122-127

Study on Quality Standard of Shuangye Granule

WANG Lian，WANG Lan，YANG Bo-han，PANG Wen-yue，ZHANG Rong-quan*
（Tianjin Institute of Pharmaceuticaland Medical Science，Tianjin 300020，China）

To develop a method ofquality controlfor Shuangye granule，the content oftotal flavonoids was determined by ultraviolet spectrophotometry and the methodology was studied；the physical，chemical and microbial indicators were detected.Total flavonoids had a good linearity over the concentration range of 0.00-45.60μg/mL（r=0.999 7）.The average recoveries was 98.92%with relatively standard deviations of1.43%.

Shuangye granule；persimmon leaf；hawthorn leaf；quality standard

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.034

王蓮（1982—），女（漢），助理研究員，碩士，主要從事天然產品和保健食品的研發和質量標準研究。

張榮泉（1964—），男，研究員，研究方向：中藥、天然藥物的開發及研究、保健食品的研究開發申報及生產。

2016-01-29