嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的分離鑒定及分型

張麗麗（上海邦德職業技術學院酒店管理分院，上海200444）

嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的分離鑒定及分型

張麗麗
（上海邦德職業技術學院酒店管理分院，上海200444）

采集了市場中的220份嬰兒配方乳粉，利用生理生化和分子鑒定的方法對采集樣品中的克羅諾桿菌進行了分離鑒定，檢出10株克羅諾桿菌，污染率為4.55%。利用16S rRNA和ompA基因對克羅諾桿菌進行分型分析，都將10株克羅諾桿菌分為了2個簇，但是不同分型方法各個簇中的菌株不同。結果表明16S rRNA和ompA基因可以用于克羅諾桿菌的分型，但是辨識度不高。

嬰兒配方乳粉；克羅諾桿菌；鑒定；分型

中國是嬰兒配方乳粉生產和銷售的大國，近年來消費者對嬰兒配方乳粉的安全問題也越來越關注?？肆_諾桿菌是囊括了之前阪崎腸桿菌的一個新的屬，屬于腸桿科的食源性致病菌，也是嬰兒配方乳粉中的A類致病菌[1-2]。該致病菌能夠通過污染嬰兒配方乳粉感染新生兒，從而導致壞死性小腸結腸炎、膿血癥、腦膜炎等嚴重的疾病，甚至導致患兒的死亡[3-4]。目前在國內的市售的嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌具有較高的污染率，這與克羅諾桿菌豐富的遺傳多樣性有著密切的聯系[5-6]。

本研究對國內市場中市售的嬰兒配方乳粉進行了克羅諾桿菌的分離鑒定，并利用生理生化和16S rRNA的鑒定方法對克羅諾桿菌進行了鑒定，最后采用16S rRNA和ompA基因對分離到的克羅諾桿菌進行了分子分型研究，從而有助于我們從分子層面了解污染我國嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的分子特性，為揭示克羅諾桿菌的遺傳多樣性提供了理論依據。

1　材料與儀器

1.1主要材料

1.1.1培養基

溶菌肉湯（Lysogeny Broth，LB）、緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、胰酪胨大豆瓊脂培養基（Tryptose Soya Agar，TSA）、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素（Modified lauryl sulfate tryptose vancomycin medium，mLST-Vm）、阪崎腸桿菌顯色培養基（DFI）：上述培養基均購買自青島海博生物有限公司。

1.1.2主要試劑

試驗所需引物：由諾禾致源諾禾致源生物信息科技有限公司合成；細菌全基因組DNA試劑盒：北京天根生化科技有限公司；API20E試劑盒：上海百舜生物科技有限公司；2×PCR Master Mix：北京天根生化科技有限公司；D2000：百川開泰生物技術（北京）有限公司；雙蒸水：上海榕柏生物技術有限公司；瓊脂糖：南京生興生物技術有限公司；1×TAE緩沖液：上海雙螺旋生物科技有限公司。

1.2試驗儀器

生物安全柜：山西天朗科技發展有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：濟南思卓醫療器械有限公司；恒溫培養箱：廣州市中譽儀器有限公司；高速離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；普通PCR儀：賽飛（中國）有限公司；電泳儀：北京六一儀器廠。

2　方法

2.1采樣

在本市各個超市采購嬰兒配方乳粉，共采購220份嬰兒配方乳粉。

2.2克羅諾桿菌的分離鑒定

根據參考GB 4789.40-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗》對克羅諾桿菌進行分離鑒定。

2.3克羅諾桿菌DNA的提取及16S rRNA分子分型

利用細菌全基因組DNA試劑盒提取克羅諾桿菌的DNA，利用16S rRNA的通用引物對DNA進行擴增，并送樣測序，在Genbank中對比測序后的基因序列得到菌株的鑒定結果，為了進一步利用16S rRNA分子方法對分離菌株進行分子分型，試驗方法參照婁彬彬等的報道[7]。

2.4克羅諾桿菌ompA基因的分子分型

利用克羅諾桿菌ompA的特異性引物ompA F：5’-TAGACTTTACATCGCCAGGG-3’ 和 ompA R：5’-GAGCTTTCACGTTGTCACAG-3’，對克羅諾桿菌進行特性性的擴增，擴增條件如下：94℃預變性2 min；變性94℃15 s，復性60℃15 s，延伸72℃30 s，30個循環；最后72℃延伸5 min[8]。得到的擴增產物經過瓊脂糖凝膠電泳驗證后送樣測序，最后得到克羅諾桿菌ompA的基因序列。

2.5生物信息學分析

利用MEGA6.0軟件對克羅諾桿菌16S rRNA和ompA基因序列進行最大似然算法系統發育分析。%%%%%%

3　結果與分析

3.1嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的分離鑒定

嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌分離鑒定的結果如表1所示。

利用通過GB 4789.40-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗》的方法對嬰兒配方乳粉中的克羅諾桿菌進行分離鑒定，結果顯示利用該方法，220份嬰兒配方乳粉中檢測12株疑似菌株，即在阪崎腸桿菌顯色培養基DFI中顯示出藍綠色菌落，且在TSA培養基中顯示為黃色可疑菌落。上述疑似克羅諾桿菌利用API20E試劑盒進行生化鑒定，結果顯示12株疑似克羅諾桿菌中11株為克羅諾桿菌即為陽性，1株為陰性。最后利用分子生物學的方法對生化鑒定結果進行驗證，將16S rRNA擴增產物送樣測序，并將測序所得到的序列在Genbank中比對，結果顯示11株被生化鑒定為克羅諾桿菌的菌株10株為克羅諾桿菌，其中CE8雖然在生化檢驗中為克羅諾桿菌，但是經過分子水平的比對后發現其為陰溝腸桿菌?？梢?20份嬰兒配方乳粉中分離到了10株克羅諾桿菌，該致病菌的污染率為4.55%。

表1　嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌鑒定結果Table 1　The result of identification ofthe Cronobacter spp.in powdered infantformula

3.2克羅諾桿菌16S rRNA分型

利用MEGA6.0軟件對分離得到的10株克羅諾桿菌的16S rRNA序列進行系統發育分析，結果如圖1所示。

由圖1可知，10株克羅諾桿菌被分為了2個簇，其中 CE10、CE11、CE9、CE1和 CE2為一簇，CE7、CE12、CE3、CE5和CE6為一簇。同時標尺為0.0005說明就整體而言，10株克羅諾桿菌的系統發育關系是很近的，因此雖然16S rRNA可以用于簡單的分型，但是辨識度并不高。

3.3克羅諾桿菌ompA基因的分型

圖1　克羅諾桿菌16S rRNA序列的最大似然系統發育樹Fig.1　Maximum-likelihood tree of 16S rRNA gene for Cronobacter strains

利用MEGA6.0軟件對10株克羅諾桿菌ompA基因進行了系統發育分析，并得到了清晰的系統發育關系，如圖2所示。

圖2　克羅諾桿菌ompA基因序列的最大似然系統發育樹Fig.2　Maximum-likelihood tree of ompA gene for Cronobacter strains

由圖2可知，10株克羅諾桿菌的ompA基因被分為了兩個簇，一簇為CE11、CE2、CE3、CE10、CE9、CE1、CE6、CE5和CE7，一簇為CE12，且CE12明顯遠離了其他的9株克羅諾桿菌，這說明CE12的ompA基因明顯區別于其他9株菌。ompA基因與克羅諾桿菌的侵染能力和致病能力有關，因此CE12可能具有特殊的侵染能力。此外我們發現利用ompA基因對克羅諾桿菌分型的辨識度較低。

4　結論與討論

在本研究中市售的嬰兒配方乳粉克羅諾桿菌的污染率為4.55%，這表明克羅諾桿菌仍是嬰兒配方乳粉中重要的致病菌。在2014年的調查中克羅諾桿菌的污染率為4.3%[11]，這與我們的研究結果相似，此外一些研究也表明在嬰兒配方乳粉的生產過程中包裝環節是最易被克羅諾桿菌污染的環節之一[1，11]。在本研究中，我們利用了生理生化和分子鑒定的方法對嬰兒配方乳粉中的克羅諾桿菌進行分離鑒定，利用GB 4789.40-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗》的方法，12株克羅諾桿菌的疑似菌株被分離鑒定，經過API20E的20個生理生化指標的鑒定發現12個疑似菌株中11個為克羅諾桿菌，而16S rRNA分子鑒定的結果則表明12株克羅諾桿菌疑似菌株中10個為克羅諾桿菌，這表明API20E的鑒定方法優于顯色性培養基的鑒定方法，但是16S rRNA的分子鑒定方法可以從分子層面對克羅諾桿菌進行鑒定，比API20E的生理生化鑒定更具優越性。

16S rRNA是最常見的用于克羅諾桿菌分型的基因之一[1]。婁彬彬等利用16S rRNA對分離自嬰兒配方乳粉中的阪崎克羅諾桿菌進行了分子分型，并發現16S rRNA分子分型的辨識度有限，但是仍能對阪崎克羅諾桿菌進行分子分型[7]。ompA基因是編碼克羅諾桿菌外膜蛋白A的重要基因，與克羅諾桿菌的致病能力有關[8]。我們的研究表明此基因也可以用于克羅諾桿菌的分子分型，且具有一定的辨識度。此外，在目前克羅諾桿菌分子分型的研究中，ITS序列分型、脈沖場電泳分型、多位點序列分型等方法也已經用于克羅諾桿菌的分型中[6，9-10]。

[1]Peng F,Chaoxin M,Binbin L,etal.Genotyping and source tracking of Cronobacter sakazakii and C.malonaticus isolates from powdered infant formula and an infantformula production factory in China[J]. Applied&EnvironmentalMicrobiology,2015,81(16):5430-5439

[2]董曉暉,李程思,吳清平,等.食品污染克羅諾桿菌(阪崎腸桿菌)的分離及鑒定[J].微生物學報,2013,53(5):429-436

[3]王翔,祝長青,徐幸蓮,等.阪崎腸桿菌(克羅諾桿菌屬)分子檢測方法研究進展[J].食品科學,2011(13):350-354

[4]董曉暉,吳清平,莫樹平,等.克羅諾桿菌檢測方法研究進展[J].華中農業大學學報,2013,32(1):130-136

[5]Sumyya H,Susan J,Forsythe S J.Cronobacter sakazakii ST4 Strains and Neonatal Meningitis,United States[J].Emerging Infectious Diseases,2013,19(1):175-177

[6]Joseph S,SonbolH,HaririS etal.Diversity ofthe Cronobacter genus as revealed by multilocus sequence typing[J].Journal of Clinical Microbiology,2012,50(9):3031-3039

[7]婁彬彬,滿朝新,費鵬,等.阪崎克羅諾桿菌的16S rDNA鑒定分型[J].中國食物與營養,2015,21(7):39-42

[8]Ks M N M V.Cloning and sequencing of the ompA gene of Enterobacter sakazakii and development of an ompA-targeted PCR for rapid detection of Enterobacter sakazakii in infant formula[J].Applied&Environmental Microbiology,2006,72(4):2539-2546

[9]牛婕婷,滿朝新,費鵬,等.阪崎克羅諾桿菌的ITS序列分析[J].中國食物與營養,2015,21(3):27-30

[10]柴云雷,滿朝新,盧雁,等.PFGE與16S rDNA對阪崎克羅諾桿菌分型的研究[J].中國乳品工業,2014,42(10):11-14

Isolation，Identification and Type of the Cronobacter spp.in Powdered Infant Formula

ZHANG Li-li
（Hospitality Elite School，Shanghai Bangde Vocational College，Shanghai200444，China）

220 powdered infant formula samples were collected from markets.10 Cronobacter strains were isolated and identified using the physiological，biochemical and molecular identification methods，with a contamination rate of 4.55%.10 Cronobacter strains were divided into two clusters respectively by the 16S rRNA and ompA genes analysis，however，the composition of strains were different in each cluster by different methods. The above results showed that the 16S rRNA and ompA genes could be used for the Cronobacter type with the nothigh distinguishability.

powdered infantformula；Cronobacter spp.；identification；type

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.039

張麗麗（1982—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學。

2016-03-02